Summary

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Abstract

El pez cebra adulto (Danio rerio) exhibe un rico repertorio de comportamientos para estudiar las funciones cognitivas. También tienen un cerebro en miniatura que se puede utilizar para medir las actividades en todas las regiones del cerebro a través de métodos de imágenes ópticas. Sin embargo, los informes sobre el registro de la actividad cerebral en el pez cebra adulto han sido escasos. El presente estudio describe los procedimientos para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal del pez cebra adulto. Nos centramos en los pasos para evitar que los peces cebra adultos muevan la cabeza, lo que proporciona una estabilidad que permite la obtención de imágenes de escaneo láser de la actividad cerebral. Los animales con la cabeza sujeta pueden mover libremente las partes de su cuerpo y respirar sin ayudas. El procedimiento tiene como objetivo acortar el tiempo de la cirugía del reposacabezas, minimizar el movimiento del cerebro y maximizar el número de neuronas registradas. Aquí también se describe una configuración para presentar un entorno visual inmersivo durante las imágenes de calcio, que se puede utilizar para estudiar los correlatos neuronales subyacentes a los comportamientos desencadenados visualmente.

Introduction

Las imágenes de fluorescencia de calcio con indicadores codificados genéticamente o colorantes sintéticos han sido un método poderoso para medir la actividad neuronal en animales que se comportan, incluidos primates no humanos, roedores, aves e insectos. La actividad de cientos de células, hasta aproximadamente 800 μm por debajo de la superficie del cerebro, puede medirse simultáneamente utilizando imágenes multifotónicas 2,3. La actividad de tipos celulares específicos también se puede medir mediante la expresión de indicadores de calcio en poblaciones neuronales definidas genéticamente. La aplicación del método de imagen para modelos de pequeños vertebrados abre nuevas posibilidades en el campo de la computación neuronal en todas las regiones cerebrales.

El pez cebra es un sistema modelo ampliamente utilizado en la investigación en neurociencia. Las larvas de pez cebra alrededor de 6 días después de la fertilización se han utilizado para obtener imágenes de calcio debido a su cerebro en miniatura y su cuerpo transparente4. Los peces cebra juveniles (3-4 semanas de edad) también se utilizan para estudiar los mecanismos neuronales que subyacen a las vías sensoriomotoras 5,6. Sin embargo, el nivel máximo de rendimiento para conductas complejas, incluyendo el aprendizaje asociativo y las conductas sociales, se alcanza a una edad más avanzada 7,8. Por lo tanto, se requiere un protocolo confiable para estudiar múltiples funciones cognitivas en el cerebro de peces cebra adultos utilizando métodos de imagen. Mientras que las larvas de pez cebra y los peces cebra juveniles pueden incluirse en agarosa para obtener imágenes in vivo, los peces cebra adultos a los 2 meses o más sufren de hipoxia en tales condiciones y son físicamente demasiado fuertes para ser restringidos por agarosa. Por lo tanto, se requiere un procedimiento quirúrgico para estabilizar el cerebro y permitir que el animal respire libremente a través de las branquias.

Aquí, describimos un protocolo de reposacabezas que implica un diseño novedoso de una sola barra para la cabeza. El tiempo quirúrgico reducido de 25 min es dos veces más rápido que el método anterior9. También describimos el diseño de la cámara de registro (tanque semihexagonal), la etapa de la cabeza y un mecanismo de bloqueo rápido para combinar las dos partes9. Por último, también se describe la configuración para presentar un estímulo visual inmersivo para estudiar la actividad y los comportamientos cerebrales activados visualmente. En general, los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para realizar imágenes de calcio de dos fotones en poblaciones celulares definidas genéticamente en un pez cebra adulto con la cabeza restringida, lo que permite la investigación de las actividades cerebrales durante varios paradigmas de comportamiento.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con los lineamientos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Academia Sinica. Los detalles de las herramientas de investigación se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. 1. Preparación de la cámara de registro Prepare un tanque semihexagonal, una placa base y una etapa de cabeza (Figura 1A; Legajos Complementa…

Representative Results

El protocolo consta de dos partes: cirugía de reposacabezas e imágenes de calcio de dos fotones de las actividades neuronales en el prosencéfalo. El éxito de la cirugía se define por la supervivencia del animal y la estabilidad del reposacabezas. La tasa de supervivencia puede mejorarse en gran medida mediante la perfusión frecuente de una solución de TMS al 0,01% a través de la boca durante la cirugía. Los peces deben recuperarse de la anestesia y respirar activamente dentro de 1-2 minutos después de sumergirs…

Discussion

Aquí, describimos un protocolo detallado para sujetar la cabeza de un pez cebra adulto para obtener imágenes de calcio de dos fotones. Hay dos pasos críticos para lograr un reposacabezas que sea lo suficientemente estable para las imágenes de escaneo láser. Primero, la barra de la cabeza debe pegarse a los sitios de fijación específicos de los cráneos. Otras partes del cráneo suelen ser demasiado delgadas para proporcionar estabilidad mecánica e incluso pueden fracturarse durante los movimientos fuertes del cue…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo del Instituto de Biología Molecular, la Academia Sinica y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. El Taller de Máquinas del Instituto de Física de la Academia Sinica ayudó a fabricar piezas diseñadas a medida. También queremos agradecer a P. Argast (Instituto Friedrich Miescher de Investigación Biomédica, Basilea, Suiza) por el diseño del mecanismo de bloqueo rápido de la platina de la cabeza.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

Referências

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
  5. Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
  6. Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
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  12. Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).

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Citar este artigo
Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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