Summary

Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.

Abstract

Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.

Introduction

Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten1. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessenwerden 2,3. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werden. Die Anwendung des bildgebenden Verfahrens für kleine Wirbeltiermodelle eröffnet neue Möglichkeiten im Bereich der neuronalen Berechnung über Hirnregionen hinweg.

Zebrafische sind ein weit verbreitetes Modellsystem in der neurowissenschaftlichen Forschung. Zebrafischlarven etwa 6 Tage nach der Befruchtung wurden aufgrund ihres Miniaturgehirns und ihres transparenten Körpers für die Kalziumbildgebung verwendet4. Juvenile Zebrafische (3-4 Wochen alt) werden auch verwendet, um die neuronalen Mechanismen zu untersuchen, die sensomotorischen Bahnen zugrunde liegen 5,6. Das maximale Leistungsniveau für komplexe Verhaltensweisen, einschließlich assoziativem Lernen und sozialem Verhalten, wird jedoch im Alter von 7,8 Jahren erreicht. Daher ist ein zuverlässiges Protokoll erforderlich, um mehrere kognitive Funktionen im Gehirn erwachsener Zebrafische mit bildgebenden Verfahren zu untersuchen. Während Zebrafischlarven und juvenile Zebrafische für die In-vivo-Bildgebung in Agarose eingebettet werden können, leiden erwachsene Zebrafische ab 2 Monaten unter solchen Bedingungen an Hypoxie und sind körperlich zu stark, um durch Agarose zurückgehalten zu werden. Daher ist ein chirurgischer Eingriff erforderlich, um das Gehirn zu stabilisieren und dem Tier die freie Atmung durch die Kiemen zu ermöglichen.

Hier beschreiben wir ein Kopfstützenprotokoll, das ein neuartiges Design eines einzelnen Kopfbügels beinhaltet. Die verkürzte Operationszeit von 25 Minuten ist doppelt so schnell wie bei der bisherigen Methode9. Wir beschreiben auch das Design der Aufnahmekammer (halbsechseckiger Tank), der Kopfstufe und eines Schnellverschlussmechanismus, um die beiden Teile9 zu verbinden. Abschließend wird auch der Aufbau zur Präsentation eines immersiven visuellen Stimulus zur Untersuchung visuell ausgelöster Gehirnaktivität und -verhaltensweisen beschrieben. Insgesamt können die hier beschriebenen Verfahren zur Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung in genetisch definierten Zellpopulationen in einem kopfgebundenen adulten Zebrafisch verwendet werden, was die Untersuchung von Gehirnaktivitäten während verschiedener Verhaltensparadigmen ermöglicht.

Protocol

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle. 1. Vorbereitung der Aufnahmekammer Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe…

Representative Results

Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: der Kopfstützenchirurgie und der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung neuronaler Aktivitäten im Vorderhirn. Der Erfolg einer Operation wird durch das Überleben des Tieres und die Stabilität der Kopfstütze bestimmt. Die Überlebensrate kann durch häufige Perfusion von 0,01%iger TMS-Lösung durch den Mund während der Operation stark verbessert werden. Die Fische sollten sich von der Narkose erholen und innerhalb von 1-2 Minuten aktiv atmen, nachdem sie in das Wasser des Aquariums e…

Discussion

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, und dem National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt. Die Maschinenwerkstatt des Instituts für Physik der Academia Sinica half bei der Herstellung von kundenspezifischen Teilen. Wir danken auch P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) für die Konstruktion des Schnellverschlussmechanismus der Kopfstufe.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

Referências

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
  5. Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
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Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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