To-foton calciumbilleddannelse af forhjerneaktivitet i opførende voksne zebrafisk
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udføre to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk.
Abstract
Voksne zebrafisk (Danio rerio) udviser et rigt repertoire af adfærd til at studere kognitive funktioner. De har også en miniaturehjerne, der kan bruges til at måle aktiviteter på tværs af hjerneområder gennem optiske billeddannelsesmetoder. Imidlertid har rapporter om registrering af hjerneaktivitet i opførende voksne zebrafisk været sparsomme. Denne undersøgelse beskriver procedurer til udførelse af to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk. Vi fokuserer på trin til at forhindre voksne zebrafisk i at bevæge hovedet, hvilket giver stabilitet, der muliggør laserscanningsbilleddannelse af hjerneaktiviteten. De hovedfastholdte dyr kan frit bevæge deres kropsdele og trække vejret uden hjælpemidler. Proceduren sigter mod at forkorte tiden for nakkestøttekirurgi, minimere hjernens bevægelse og maksimere antallet af registrerede neuroner. En opsætning til præsentation af et fordybende visuelt miljø under calciumbilleddannelse er også beskrevet her, som kan bruges til at studere neurale korrelater underliggende visuelt udløst adfærd.
Introduction
Calciumfluorescensbilleddannelse med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske farvestoffer har været en kraftfuld metode til måling af neuronal aktivitet i dyr, herunder ikke-menneskelige primater, gnavere, fugle og insekter1. Aktiviteten af hundredvis af celler, op til ca. 800 μm under hjerneoverfladen, kan måles samtidigt ved hjælp af multifotonbilleddannelse 2,3. Aktiviteten af specifikke celletyper kan også måles ved at udtrykke calciumindikatorer i genetisk definerede neuronale populationer. Anvendelse af billeddannelsesmetoden til små hvirveldyrmodeller åbner nye muligheder inden for neuronal beregning på tværs af hjerneområder.
Zebrafisk er et meget anvendt modelsystem inden for neurovidenskabelig forskning. Larvezebrafisk omkring 6 dage efter befrugtning er blevet brugt til calciumbilleddannelse på grund af deres miniaturehjerne og gennemsigtige krop4. Unge zebrafisk (3-4 uger gamle) bruges også til at studere de neurale mekanismer, der ligger til grund for sensorimotoriske veje 5,6. Imidlertid nås det maksimale præstationsniveau for kompleks adfærd, herunder associativ læring og social adfærd, i en ældre alder 7,8. Således kræves en pålidelig protokol for at studere flere kognitive funktioner i hjernen hos voksne zebrafisk ved hjælp af billeddannelsesmetoder. Mens zebrafisklarve og unge zebrafisk kan indlejres i agarose til in vivo-billeddannelse, lider voksne zebrafisk på 2 måneder eller ældre af hypoxi under sådanne forhold og er fysisk for stærke til at blive fastholdt af agarose. Derfor kræves en kirurgisk procedure for at stabilisere hjernen og gøre det muligt for dyret at trække vejret frit gennem gællerne.
Her beskriver vi en nakkestøtteprotokol, der involverer et nyt design af en enkelt hovedstang. Den reducerede operationstid på 25 min er dobbelt så hurtig som den tidligere metode9. Vi beskriver også designet af optagekammeret (semi-sekskantet tank), hovedtrinnet og en hurtiglåsemekanisme til at kombinere de to dele9. Endelig beskrives opsætningen til at præsentere en fordybende visuel stimulus til at studere visuelt udløst hjerneaktivitet og adfærd også. Samlet set kan de procedurer, der er beskrevet her, bruges til at udføre to-foton calciumbilleddannelse i genetisk definerede cellepopulationer i en hovedbehersket voksen zebrafisk, hvilket muliggør undersøgelse af hjerneaktiviteter under forskellige adfærdsparadigmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at fastholde hovedet af voksne zebrafisk til to-foton calciumbilleddannelse. Der er to kritiske trin for at opnå en nakkestøtte, der er stabil nok til laserscanningsbilleddannelse. Først skal hovedstangen limes på kraniernes specifikke fastgørelsessteder. Andre dele af kraniet er ofte for tynde til at give mekanisk stabilitet og kan endda blive brudt under stærke kropsbevægelser. For det andet skal huden over fastgørelsesstederne fjernes grundigt. Resterende vand skal o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinværkstedet ved Institut for Fysik, Academia Sinica hjalp med at fremstille specialdesignede dele. Vi vil også gerne takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) for designet af hurtiglåsemekanismen på hovedscenen.
Materials
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen – GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
Referências
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
