פרוטוקול זה מאפשר לחשוף את ההשפעה של פרופג’ים על המארחים שלהם. תרביות חיידקים מסונכרנות באמצעות תנאים התומכים בצורה הטובה ביותר במצב הליזוגני, ומגבילים את ההשראה הספונטנית. RT-qPCR מבדיל באופן חד-משמעי בין גנים מוגבלים לפאגים לבין אלה שאינם מצומדים מבקרת פאגים לבין אלה המתבטאים במהלך מחזור השכפול הליטי.
פאגים ממוזגים נמצאים משולבים כפרופאגים ברוב הגנומים של חיידקים. חלק מהפרופג’ים הם קריפטיים ומקובעים בכרומוזום החיידקי, אך אחרים פעילים ויכולים להיות מופעלים לצורה משוכפלת באופן ספונטני או על ידי חשיפה לגורמים מעוררים. פרופג’ים קשורים בדרך כלל ליכולת להעניק ייצור רעלנים או תכונות אחרות הקשורות לאלימות על התא המארח שלהם. מחקרים עדכניים יותר הראו שהם יכולים לשחק תפקיד הרבה יותר גדול בשינוי הפיזיולוגיה של המארחים שלהם. הטכניקה המתוארת כאן אפשרה לנו לחקור כיצד פרופג’ים משפיעים על ביטוי גנים בחיידק האופורטוניסטי Pseudomonas aeruginosa.
בעבודה זו, הגידול של זן הבר P. aeruginosa PAO1 הושווה לזה של ליסוגנים איזוגניים הנושאים שילובים שונים של פרופג’ים מזן המגיפה ליברפול (LES) LESB58. בתרבית ליזוגן, חלק מתאי החיידקים יתמכו בשכפול בקטריופאג’ ליטי (אינדוקציה ספונטנית) עם רמת ביטוי גבוהה לכל תא של גנים מאוחרים של פאגים, כגון אלה הקשורים להרכבה של חלקיקי פאגים, ובכך יסוו את ביטוי הגנים ברמה נמוכה הקשור לביטוי גנים מוגבלים בליזוגן. ההשפעה של אינדוקציה ספונטנית יכולה אפוא לטשטש את ביטוי הגנים של פרופאג’ באוכלוסיית ליזוגן.
ניסויי פרופיל גדילה שימשו לזיהוי אינדוקציה ספונטנית, שהייתה מינימלית בשלב הצמיחה המעריכית המוקדמת. מחקר זה מדווח כיצד להכין תרביות מדגם במהלך שלב הצמיחה המעריכית המוקדמת וכיצד להגדיר בקרות נאותות למרות מספר התאים הנמוך. פרוטוקולים אלה מבטיחים השוואה אמינה וניתנת לשחזור של חיידקים מסוג בר וליזוגניים בתנאים שונים, ובכך משפרים את פרופיל השעתוק של גנומים פרופאגים ומסייעים בזיהוי פונקציות פרופאגים שלא הוכרו בעבר.
לאחרונה, טיפול בפאגים להתמודדות עם עמידות מיקרוביאלית1 ועריכת גנים מבוססת CRISPR-Cas2 עוררו עניין מחודש במחקר הבקטריופאג’ים. שוב, ההתקדמות בביוטכנולוגיה אפשרה חקירה עמוקה יותר של יחסי הגומלין בין חיידקים ופאגים3. עם זאת, השימוש הטיפולי בפאגים (“טיפול בפאגים”) נפגע על ידי חששות לגבי פאגים הפועלים כאלמנטים גנטיים ניידים עם יכולת להעביר גנים של אלימות והתנגדות אופקית4. המרחב של “החומר האפל”5 (גנים בעלי תפקידים לא ידועים) מטריד ומפתה. החומר האפל נחשב לפער בהבנתנו את הביולוגיה של הפאגים ולמשאב בלתי מנוצל במידה רבה לכלים מולקולריים ולטיפולים חדשניים פוטנציאליים6. הפיתוח של טכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה, יחד עם ביאור גנים משופר 7,8,9 ואלגוריתמים חדשים לקיפול פפטידים 10, משפר את האיתור, התיאור והחיזוי הפונקציונלי של גני פאגים. עם זאת, המדע עדיין רחוק מלאמת את תפקודי הגנים של רוב הפאגים בתרבית או בעולם האמיתי.
ריצוף RNA (RNA-Seq) יכול למפות באופן גלובלי ביטוי גנים במהלך זיהום פאגים ושיפר באופן משמעותי את ההבנה הן של הפאגים והן של יסודות חיידקיים המעורבים במחזורים ליטיים וליזוגניים11,12. במהלך תהליכים ליזוגניים, גנומים של פאגים ממוזגים משולבים בדנ”א חיידקי והופכים לפרופג’ים13. ניתן להשתמש בניסויי פרופיל ביטוי גנים גלובליים כדי לזהות גנים מוגבלים לפאג’ים המקודדים על גנום פאגים ממוזגים אך באים לידי ביטוי רק במצב ליזוגני11. גנים כאלה אינם מקודדים חלבונים מבניים של פאגים ואינם מעורבים בתהליכי זיהום פאגים כלשהם. RNA-Seq יכול לשמש לזיהוי אותם גנים בעלי סבירות גבוהה יותר להשפיע על הביולוגיה של החיידק המארח, בין אם על ידי גרימת רווח של תפקוד או ויסות הגנים החיידקיים הקיימים, ובכך לעתים קרובות מאפשר לחיידקים להסתגל לסביבות משתנות. לכן, ניתן לחקור את יכולתם של פרופג’ים לפעול כמאסטרים של בובות מיקרוביאליות, השולטים במגוון תפקודים חיידקיים.
ישנם שני חסמים עיקריים לניתוח יעיל של ביטוי גנים מוגבלים על ידי פרופג’ים. ראשית, הזמינות של מארחים רגישים היא נושא מפתח. בהגדרה, פרופג’ים כבר משולבים בגנום המארח הספציפי שלהם, ולכן מאתגר למצוא פונדקאי רגיש מסוג בר כדי להשוות את ביטוי הגנים העולמי בנוכחות ובהיעדר הפרופאג’. ניתן להשיג זאת באמצעות הדבקה דה נובו של פונדקאי רגיש אחר או מחיקת הפרופאג’ מהמבודד המקורי מסוג פרא, מבלי לשבש את שאר הגנום המארח. המחסום השני טמון באופי ההטרוגני של אוכלוסיות ליזוגניות. חלק מהפרופג’ים מתפרקים באמצעות מוטציה או רקומבינציה והופכים ל”קריפטיים”, כלומר הם קבועים במיקום מסוים של גנום החיידק. עם זאת, פרופג’ים אחרים הם “פעילים” וניתן להשרות אותם למחזור רפליקטיבי, ליטי באופן ספונטני או לאחר חשיפה לגורמים מעוררים. בתרביות ליזוגניות רבות, קצב האינדוקציה הספונטנית פירושו שחלק מתאי החיידק עוברים תמיד שכפול פאגים ליטי14,15,16. רמה גבוהה של ביטוי גנים מאוחרים של פאגים באוכלוסיות אלה מסווה את ביטוי הגנים ברמה נמוכה הקשור לביטוי גנים מוגבלים בליזוגן11,17. שיעור הליזוגנים העוברים אינדוקציה פרופגית ספונטנית עשוי להשתנות בהתאם למצב הגדילה, תנאי הצמיחה או גורמים אחרים. לכן, כדי לחקור את ההשפעות של פרופג’ים על הליזוגן, יש למזער ככל האפשר אירועי אינדוקציה ספונטניים של פרופאגים על ידי אופטימיזציה של תנאי הגידול לטובת המצב הליזוגני.
מחקר זה מדווח על עבודת ההכנה שנעשתה כדי לחקור את ההשפעה של קבוצה של פרופג’ים החיים יחד מזן המגיפה ליברפול (LES) של Pseudomonas aeruginosa. פרופג’ים פעילים הושרו ובודדו מ-LES ושימשו להדבקת זן המארח P. aeruginosa, PAO116,18,19. כל הגנום של זן P. aeruginosa מסוג פראי, PAO1, והליזוגן שלו, PAO1Φ2, רוצפו (בעומק כיסוי של פי 30) כדי להבטיח את זהות הזן הפראי וכדי לאשר שהליזוגן איזוגני. LES נקשר לתחלואה ותמותה מוגברת בחולי סיסטיק פיברוזיס, והוצע כי LES phages 19 מסייע להסתגלות לסביבת הריאה של סיסטיק פיברוזיס16,19,20. למרות ראיות חזקות לכך שפרופג’ים אלה משפיעים על הביולוגיה של המאכסן שלהם20,21, רוב תפקודי הגנים שלהם עדיין לא מאופיינים, ומנגנוני האינטראקציה הספציפיים אינם מובנים היטב. גישת שעתוק יכולה לחשוף אמפירית את תפקודי גן הפרופאג’ ברקע מארח מבוקר. מכיוון שאינדוקציה ספונטנית יכולה להשפיע על פרופילי ביטוי, מאמר זה מתאר כיצד לייעל את תנאי הגידול לטובת המצב הליזוגני. סנכרון כזה של תרביות יכול להיות מאומת על ידי PCR בזמן אמת כדי לכמת את רמות הביטוי של סמנים גנטיים מרכזיים הקשורים לשלבים מכריעים של שכפול פאגים LES ב- PAO1. אותה גישה שימשה בעבר לזיהוי הפונקציות המוגבלות של פאגים שיגה-טוקסיגניים המשפיעים על תנועתיות, עמידות לחומצה ועמידות מיקרוביאלית ב- Escherichia coli11,17,21,22.
יצירתו של מארח אינדיקטור ניתן לבחירה, ששימש בעבר במבחני פלאק כדי לכמת בצורה מדויקת יותר את האינדוקציה הספונטנית של פאג Stx מ- E. coli MC106137,38,39, תוארה כאן עבור P. aeruginosa phage LESΦ2. להתערבות זו יש יתרון נוסף של הפחתת שלבי עיבוד הדגימה והזמן, ובכך מאפשרת הערכה בו זמנית של שיעורי אינדוקציה ספונטניים בתנאי תרבית מרובים. קיים סיכון ליצירת מוטציות אחרות במהלך יצירת וריאנטים עמידים לריפמפיצין40; עם זאת, בעבודה זו, הזן המפותח שימש רק כמארח אינדיקטור לספירת רבדים מתרבויות מעניינות ולא נכלל בניתוח התמלול. כל עוד זן האינדיקטור הניתן לבחירה נותר רגיש באותה מידה להדבקה על ידי הפאג המעניין, אין חשש לגבי מוטציות נרכשות אחרות. עם זאת, לא זוהו הבדלים בפרופילי הפולימורפיזם של אורך מקטע ההגבלה על ידי ניתוח אלקטרופורזה של ג’ל שדה דופק (PFGE) של PAO1WT ו- PAO1RIF (הנתונים אינם מוצגים).
בעת בחירת תאים מארחים, נדיר למצוא זן אינדיקטור שאינו מכיל כבר פרופגים. לדוגמה, PAO1 מכיל את הפרופאג’ Pf4. בקרות הניסוי במחקר זה תוכננו כך שיהיו מסוגלות לבחון ישירות את ביטוי הגנים של פאגים ספציפיים (במקרה זה, LES prophage 2) ואת ההשפעות שיש לפאג’ זה על ביטוי גנים חיידקיים. בהשוואה בין תעתיקים מ-PAO1 הנושאים את LES prophage 2 וחסרים את LES prophage 2 (הן lysogen והן non-lysogen נושאים את Pf4 האנדוגני), המשמשים כבקרות פנימיות כדי לשלול את ההשפעה של Pf4 על המארח. בנוסף, הוכח כי Pf4 בדרך כלל אינו גורם לליזה בתא המארחשלו 41 ולכן אינו מסוגל לבלבל את התוצאות של ניסויים אלה.
ידוע היטב כי בקרת איכות זהירה היא חיונית בהכנת הדגימות להפקת נתוני אומיקס משמעותיים42. עם זאת, כפי שתואר קודם לכן11, אפיון זהיר של פעילות פרופג’ים בהכנת תרביות ליזוגן למחקרים כאלה מבוצע רק לעתים רחוקות. כאן, אנו מפרטים את הפרוטוקולים השיטתיים שלנו להכנת מערך תרביות מבוקר היטב וממוטב למחקרי שעתוק כדי לחקור טוב יותר את יחסי הגומלין בין חיידקים ופאגים ממוזגים. הסינכרוניות של האוכלוסייה נשלטה על ידי הבאת התרבית דרך לפחות ארבע הכפלות לפני שטיפלו בה עם האנטיביוטיקה המושרה נורפלקסצין. על ידי קביעת MIC של norfloxacin עבור הזן במחקר, אנו יכולים להבטיח כי הריכוז של הגורם המשרה היה בדיוק מעל MIC עבור טיפול “אינדוקציה”. התאים המטופלים דוללו ביחס של 1:10 כדי להוריד את ריכוז הנורפלקסצין מתחת למיקרופון לאחר טיפול של שעה אחת על מנת לאפשר לתאים להתאושש ולהשלים את תהליך שכפול הפאגים, המסתיים בליזה של התא ובשחרור צאצאי פאגים זיהומיים. התאים נכנסים למחזור השכפול הליטי רק לאחר גירוי האינדוקציה לאחר שריכוז הנורפלקסצין הובא מתחת למיקרופון במהלך תקופת ההחלמה. במקרה זה, מעבר מעל 1 מיקרוגרם·מ”ל−1 norfloxacin פירושו כי התרופה לא יכול להיות מדולל ביעילות מתחת למיקרופון, כמו MIC עבור norfloxacin עבור PAO1 הוא 0.19 מיקרוגרם ·mL−1. רמת דילול השראת חייבת להיות מאוזנת עם הצורך בהתאוששות ליזוגן ושמירה על צפיפות התרבית לקצירת הרנ”א. הנתונים הנדונים כאן מראים כי ניתן לסנכרן תרביות כדי ליצור דגימות שבהן הליזוגניות שולטת, ובכך להפחית את הרעש מהשראה ספונטנית ולאפשר זיהוי של שינויים אמיתיים המונעים על ידי ליזוגניות בביטוי גנים. מכיוון שהמצב הליזוגני שולט בשלב האקספוננציאלי המוקדם של הצמיחה כאשר צפיפות התא החיידקית נמוכה, אנו מציעים להרחיב את התרביות כדי לקצור מספיק RNA למחקרי ביטוי גנים עתידיים כגון RNA-Seq.
השימוש בנורפלקסצין כגורם מעורר לאלץ תרביות להיכנס למחזור הליטי מדווח היטב43,44; עם זאת, זה ישפיע גם על ביטוי של גנים חיידקיים אחרים בתהליך45,46. כדי למתן זאת, ספריות רנ”א מתרביות בר ביקורתיות שגדלו באותם תנאים מעוררים ולא מעוררים צריכות להיכלל בניסויי RNA-Seq. השימוש בבקרות פנימיות ובגנים של סמנים מרכזיים כדי לאמת את שלבי שכפול הפאגים על ידי qRT-PCR חיוני גם להשוואות מדויקות. פרופיל RT-PCR כמותי אינו יכול להתפרש על ידי השוואת המספרים המוחלטים של תעתיקים עבור כל גן בנקודות זמן שונות; צורת הפרופיל היא החשובה. ראשית, רק אזור קטן אחד בתעתיק של גן כלשהו נדגם, כך שלא ידוע אם מדובר ביסוד קצר מועד או בעל חיים ארוכים יותר27. אין ספק, מיפוי RNA-Seq של תעתיקים מראה כי צפיפות נתוני המיפוי משתנה באופן משמעותי לאורך הגן. שנית, זוהי צורת פרופיל ביטוי הגנים שיש לפרש עבור גן סמן הקשור למחזור הליטי או לאורח החיים הליזוגני או אפילו לנתק ממעגלי ויסות הפאגים11. אינדוקציה ספונטנית היא בעיה אמיתית בתרבות הליזוגן ותמיד תגרום לביטוי של גנים הקשורים למחזור הליטי. עם זאת, פרופיל מראה כי הגנים הקשורים למחזור השכפול הליטי מדוכאים בביטוי שלהם לפני האינדוקציה (לפחות שני קפלי לוג) ובפוסט-אינדוקציה מווסתת כלפי מעלה.
ניתוחי השעתוק שנערכו בעבר של אינטראקציות פאגים Stx עם E. coli תומכים בהבנה מעמיקה של גני הפאגים המעורבים בשמירה על ליזוגניות והפעלת המחזור הליטי11,17. נכון לעכשיו, הפאגים LES של P. aeruginosa כבר מבוארים, אבל תפקודי הגן העיקריים שלהם פחות מובנים. מחקרי שעתוק יאפשרו ביאור מחדש של פרופג’ים של LES וישפרו את הבנתנו את הגנים המעורבים במחזור הליזוגני והליטי. קישור רצף גנים לתפקוד מהווה אתגר גדול בחקר פרופג’ים חדשים, מה שמדגיש עוד יותר את הצורך במחקרים נוספים כדי לאשר את תפקודי גן הפאגים לייצור כלי ביאור טובים יותר47. היישום וההתאמה הרחבים יותר של הפרוטוקולים ואמצעי בקרת האיכות הנוספים המפורטים במאמר וידאו זה יכולים לסייע בחשיפת פונקציות פרופג’ים שונות, ובכך לשפר את צינורות הביאור ולשנות את הבנתנו את הפאגים והביולוגיה של חיידקים.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |