يتيح هذا البروتوكول الكشف عن تأثير النبوءات على مضيفيها. تتم مزامنة الثقافات البكتيرية باستخدام الظروف التي تدعم الحالة المحللة بشكل أفضل ، مما يحد من الحث التلقائي. يميز RT-qPCR بشكل لا لبس فيه الجينات المقيدة بالبعوض وتلك غير المنفصلة عن التحكم في العاثيات عن تلك التي يتم التعبير عنها أثناء دورة النسخ المتماثل الليتي.
تم العثور على العاثيات المعتدلة مدمجة كنبوءات في غالبية الجينومات البكتيرية. بعض النبوءات خفية وثابتة في الكروموسوم البكتيري ، لكن البعض الآخر نشط ويمكن تشغيله في شكل تكراري إما تلقائيا أو عن طريق التعرض لعوامل محفزة. ترتبط النبوءات عادة بالقدرة على منح إنتاج السموم أو غيرها من السمات المرتبطة بالفوعة على الخلية المضيفة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أنها يمكن أن تلعب دورا أكبر بكثير في تغيير فسيولوجيا مضيفيها. مكنتنا التقنية الموصوفة هنا من التحقيق في كيفية تأثير النبوءات على التعبير الجيني في البكتيريا الانتهازية Pseudomonas aeruginosa.
في هذا العمل ، تمت مقارنة نمو سلالة P. aeruginosa من النوع البري PAO1 مع نمو المحللين متساوي المنشأ الذي يحمل مجموعات مختلفة من النبوءات من سلالة ليفربول الوبائية (LES) LESB58. في مزرعة الليزوجين ، ستدعم نسبة من الخلايا البكتيرية تكرار البكتيريا lytic (الحث التلقائي) بمستوى عال من التعبير لكل خلية من جينات العاثية المتأخرة ، مثل تلك المرتبطة بتجميع جزيئات العاثية ، وبالتالي إخفاء التعبير الجيني منخفض المستوى المرتبط بالتعبير الجيني المقيد بالليزوجين. وبالتالي فإن تأثير الحث التلقائي يمكن أن يحجب التعبير الجيني للبعوض عبر مجموعة من الليزوجين.
تم استخدام تجارب تنميط النمو لتحديد الحث التلقائي ، والذي كان ضئيلا خلال مرحلة النمو الأسي المبكرة. توضح هذه الدراسة كيفية تحضير مزارع العينات خلال مرحلة النمو الأسي المبكرة وكيفية إعداد ضوابط كافية على الرغم من انخفاض أعداد الخلايا. تضمن هذه البروتوكولات مقارنة موثوقة وقابلة للتكرار بين البكتيريا من النوع البري والبكتيريا المحللة في ظل ظروف مختلفة ، وبالتالي تحسين التنميط النسخي لجينومات البروفاج والمساعدة في تحديد وظائف النبوءة غير المعترف بها سابقا.
في الآونة الأخيرة ، ولد العلاج بالعاثيات لمعالجة مقاومة مضادات الميكروبات1 وتحرير الجينات2 القائم على كريسبر-كاس اهتماما متجددا بأبحاث البكتيريا. مرة أخرى ، مكنت التطورات في التكنولوجيا الحيوية من إجراء تحقيق أعمق في التفاعلات بين البكتيريا والعاثيات3. ومع ذلك ، فإن الاستخدام العلاجي للعاثية (“العلاج بالعاثيات”) يعوقه مخاوف بشأن عمل العاثيات كعناصر وراثية متحركة مع القدرة على نقل جينات الفوعة والمقاومة أفقيا4. إن اتساع “المادة المظلمة”5 (جينات ذات وظائف غير معروفة) أمر مقلق وجذاب على حد سواء. تعتبر المادة المظلمة فجوة في فهمنا لبيولوجيا العاثيات وموردا غير مستغل إلى حد كبير للأدوات الجزيئية والعلاجات الجديدة المحتملة6. يعمل تطوير تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، جنبا إلى جنب مع تحسين التعليقات التوضيحية الجينية7،8،9 وخوارزميات طي الببتيدالجديدة 10 ، على تحسين الكشف عن جينات العاثيات ووصفها والتنبؤ الوظيفي بها. ومع ذلك ، لا يزال العلم بعيدا عن التحقق من صحة وظائف الجينات لمعظم العاثيات في الثقافة أو في العالم الحقيقي.
يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) رسم خريطة عالمية للتعبير الجيني أثناء الإصابة بالعاثيات وقد حسن بشكل كبير فهم كل من العاثيات والعناصر البكتيرية المشاركة في الدورات المحللة والحالة11,12. أثناء العمليات المحللة ، يتم دمج جينومات العاثية المعتدلة في الحمض النووي البكتيري لتصبح نبوءات13. يمكن استخدام تجارب التنميط الجيني العالمية لتحديد الجينات المقيدة بالبعوض التي يتم ترميزها على جينومات العاثية المعتدلة ولكن يتم التعبير عنها فقط خلال الحالة المحللة11. هذه الجينات لا تشفر البروتينات الهيكلية للعاثيات ولا تشارك في أي عمليات عدوى العاثيات. يمكن استخدام RNA-Seq لتحديد تلك الجينات التي من المرجح أن تؤثر على بيولوجيا المضيف البكتيري ، إما عن طريق إحداث اكتساب الوظيفة أو تنظيم الجينات البكتيرية الموجودة ، وبالتالي تمكين البكتيريا في كثير من الأحيان من التكيف مع البيئات المتغيرة. لذلك ، يمكن دراسة قدرة النبوءات على العمل كسادة دمى ميكروبية ، والتحكم في مجموعة من الوظائف البكتيرية.
هناك نوعان من العوائق الرئيسية أمام التحليل الفعال للتعبير الجيني المقيد بالبوفاج. أولا ، يعد توفر المضيفين المعرضين للخطر مشكلة رئيسية. بحكم التعريف ، يتم دمج النبوءات بالفعل في جينوم المضيف المحدد ، لذلك من الصعب العثور على مضيف من النوع البري حساس لمقارنة التعبير الجيني العالمي في وجود النبوءة وغيابها. يمكن تحقيق ذلك إما من خلال الإصابة الجديدة لمضيف آخر حساس أو حذف النبوءة من العزلة الأصلية من النوع البري ، دون تعطيل بقية الجينوم المضيف. الحاجز الثاني يكمن في الطبيعة غير المتجانسة للسكان lysogenic. تتحلل بعض النبوءات من خلال الطفرة أو إعادة التركيب لتصبح “خفية” ، مما يعني أنها ثابتة في موقع معين من الجينوم البكتيري. ومع ذلك ، فإن النبوءات الأخرى “نشطة” ويمكن تحريضها في دورة تكرارية ، تحلل تلقائيا أو بعد التعرض لعوامل محفزة. في العديد من الثقافات المحللة ، يعني معدل الحث التلقائي أن نسبة من الخلايا البكتيرية تخضع دائما لتكرار العاثية lytic14،15،16. يخفي المستوى العالي من التعبير عن جينات العاثيات المتأخرة في هذه المجموعات التعبير الجيني منخفض المستوى المرتبط بالتعبير الجيني المقيد بالليسوجين11,17. قد تختلف نسبة الليزوجينات التي تخضع لتحريض النبوء التلقائي باختلاف حالة النمو أو ظروف النمو أو المحفزات الأخرى. لذلك ، لدراسة تأثيرات النبوءات على الليزوجين ، يجب تقليل أحداث تحريض النبوء التلقائي قدر الإمكان عن طريق تحسين ظروف النمو لصالح الحالة الليزوجينية.
تقدم هذه الدراسة تقريرا عن العمل التحضيري المنجز للتحقيق في تأثير مجموعة من نبوءات التعايش من سلالة ليفربول الوبائية (LES) من Pseudomonas aeruginosa. تم تحفيز النبوءات النشطة وعزلها من LES واستخدامها لإصابة سلالة مضيف P. aeruginosa النموذجية ، PAO116،18،19. تم تسلسل الجينومات الكاملة لسلالة P. aeruginosa من النوع البري ، PAO1 ، و lysogen ، PAO1Φ2 ، (على عمق تغطية 30x) لضمان هوية السلالة البرية وللتأكد من أن الليزوجين كان متساوي المنشأ. ارتبط LES بزيادة المراضة والوفيات لدى مرضى التليف الكيسي ، وقد تم اقتراح LESphages 19 للمساعدة في التكيف مع بيئة الرئة التليف الكيسي16،19،20. على الرغم من الأدلة القوية على أن هذه النبوءات تؤثر على بيولوجيا مضيفها20,21 ، فإن غالبية وظائفها الجينية لم يتم توصيفها بعد ، والآليات المحددة للتفاعل غير مفهومة بشكل جيد. يمكن لنهج النسخ أن يكشف تجريبيا عن وظائف جين النبوءة في خلفية مضيف خاضعة للرقابة. نظرا لأن الحث التلقائي يمكن أن يؤثر على ملفات تعريف التعبير ، توضح هذه المقالة كيفية تحسين ظروف النمو لصالح الحالة الليزوجينية. يمكن التحقق من صحة هذا التزامن للثقافات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد مستويات التعبير عن العلامات الجينية الرئيسية المرتبطة بالمراحل الحاسمة من تكرار العاثية LES في PAO1. تم استخدام نفس النهج سابقا لتحديد الوظائف المقيدة للبوفاج للعاثيات السامة Shiga التي تؤثر على الحركة ومقاومة الأحماض ومقاومة مضادات الميكروبات في الإشريكية القولونية 11،17،21،22.
تم وصف إنشاء مضيف مؤشر قابل للاختيار ، كان يستخدم سابقا في مقايسات البلاك لتحديد الحث التلقائي للعاثية Stx بدقة أكبر من E. coli MC106137،38،39 ، هنا ل P. aeruginosa phage LESΦ2. هذا التدخل له فائدة إضافية تتمثل في تقليل خطوات ووقت معالجة العينات ، وبالتالي تمكين التقييم المتزامن لمعدلات الحث التلقائي في ظروف الاستزراع المتعددة. هناك خطر من توليد طفرات أخرى أثناء إنشاء متغيرات مقاومة للريفامبيسين40 ؛ ومع ذلك ، في هذا العمل ، تم استخدام السلالة المتطورة فقط كمضيف مؤشر لتعداد اللوحات من الثقافات ذات الأهمية ولم يتم تضمينها في تحليل النسخ. طالما أن سلالة المؤشر القابلة للاختيار تظل عرضة بنفس القدر للإصابة بالعاثية ذات الاهتمام ، فلا داعي للقلق بشأن الطفرات المكتسبة الأخرى. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي اختلافات في ملامح تعدد الأشكال لطول جزء التقييد من خلال تحليل الرحلان الكهربائي لمجال النبض (PFGE) ل PAO1WT و PAO1RIF (البيانات غير معروضة).
عند اختيار الخلايا المضيفة ، من النادر العثور على سلالة مؤشر لا تحتوي بالفعل على نبوءات. وكمثال على ذلك ، فإن PAO1 يؤوي البروفاج الخيطي Pf4. تم تصميم الضوابط التجريبية لهذه الدراسة لتكون قادرة على الفحص المباشر للتعبير الجيني لعاثيات معينة (في هذه الحالة ، LES prophage 2) وتأثيرات هذه العاثية على التعبير الجيني البكتيري. في مقارنة النصوص من PAO1 التي تحمل نبوءة LES 2 وتفتقر إلى نبوءة LES 2 (يحمل كل من الليزوجين وغير الليزوجين Pf4 الداخلي) ، والتي تعمل كضوابط داخلية لاستبعاد تأثير Pf4 على المضيف. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن Pf4 عادة لا يسبب التحلل في الخلية المضيفة41 ، وبالتالي فهو غير قادر على إرباك نتائج هذه التجارب.
من الثابت أن مراقبة الجودة الدقيقة أمر بالغ الأهمية في إعداد العينات لإنتاج بيانات omics ذات مغزى42. ومع ذلك ، كما هو موضح سابقا11 ، نادرا ما يتم إجراء التوصيف الدقيق لنشاط النبوءة في إعداد ثقافات الليسوجين لمثل هذه الدراسات. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكولاتنا المنهجية لإعداد مجموعة من الثقافات التي يتم التحكم فيها جيدا والمحسنة للدراسات النسخية لاستكشاف التفاعلات بين البكتيريا والعاثيات المعتدلة بشكل أفضل. تم التحكم في تزامن السكان عن طريق جلب الثقافة من خلال أربعة مضاعفة على الأقل قبل معالجتها بالمضاد الحيوي المستحث نورفلوكساسين. من خلال تحديد MIC للنورفلوكساسين للسلالة في الدراسة ، يمكننا التأكد من أن تركيز العامل المحفز كان أعلى بقليل من MIC للعلاج “التعريفي”. ثم تم تخفيف الخلايا المعالجة 1:10 لخفض تركيز النورفلوكساسين تحت MIC بعد العلاج لمدة ساعة واحدة من أجل السماح للخلايا باستعادة وإكمال عملية تكرار العاثية ، وتنتهي بتحلل الخلية وإطلاق ذرية العاثية المعدية. تدخل الخلايا فقط في دورة النسخ المتماثل بعد تحفيز الحث بمجرد أن يتم نقل تركيز النورفلوكساسين إلى ما دون MIC خلال فترة الاسترداد. في هذه الحالة ، فإن تجاوز 1 ميكروغرام · مل − 1 نورفلوكساسين يعني أنه لا يمكن تخفيف الدواء بشكل فعال تحت MIC ، حيث أن MIC للنورفلوكساسين ل PAO1 هو 0.19 ميكروغرام · مل −1. يجب موازنة مستوى تخفيف المحفز مع الحاجة إلى استعادة الليسوجين والاحتفاظ بكثافة الثقافة لحصاد الحمض النووي الريبي. توضح البيانات التي تمت مناقشتها هنا أنه من الممكن مزامنة الثقافات لإنشاء عينات يهيمن فيها الليزوجيني ، وبالتالي تقليل الضوضاء الناتجة عن الحث التلقائي وتمكين الكشف عن التغيرات الحقيقية التي يحركها الليزوجيني في التعبير الجيني. نظرا لأن الحالة المحللة هي السائدة في المرحلة الأسية المبكرة من النمو عندما تكون كثافة الخلايا البكتيرية منخفضة ، فإننا نقترح توسيع نطاق الثقافات لحصاد ما يكفي من الحمض النووي الريبي لدراسات التعبير الجيني اللاحقة مثل RNA-Seq.
تم الإبلاغ عن استخدام النورفلوكساسين كعامل محفز لإجبار الثقافات على الدخول في الدورة lytic بشكل جيد43,44 ؛ ومع ذلك ، سيؤثر هذا أيضا على التعبير عن الجينات البكتيرية الأخرى في العملية45,46. للتخفيف من ذلك ، يجب تضمين مكتبات الحمض النووي الريبي من الثقافات البرية الضابطة التي تزرع في ظل نفس الظروف المحفزة وغير المحفزة في تجارب RNA-Seq. يعد استخدام الضوابط الداخلية وجينات العلامات الرئيسية للتحقق من صحة مراحل تكرار العاثيات بواسطة qRT-PCR أمرا بالغ الأهمية لإجراء مقارنات دقيقة. لا يمكن تفسير التنميط الكمي RT-PCR من خلال مقارنة الأعداد المطلقة للنسخ لكل جين في نقاط زمنية مختلفة. إنه شكل الملف الشخصي الذي يهم. أولا ، تم أخذ عينات من منطقة صغيرة واحدة فقط في النسخة لأي جين ، لذا فإن ما إذا كان عنصرا قصير العمر أو أطول عمرا غير معروف27. بالتأكيد ، يظهر رسم خرائط RNA-Seq للنصوص أن كثافة بيانات رسم الخرائط تختلف اختلافا كبيرا على طول الجين. ثانيا ، هو شكل ملف تعريف التعبير الجيني الذي يجب تفسيره لجين علامة مرتبط بالدورة lytic أو نمط الحياة lysogenic أو حتى غير مفصول عن الدوائر التنظيمية للعاثيات11. يعد الحث التلقائي مشكلة حقيقية في ثقافة الليزوجين وسيؤدي دائما إلى التعبير عن الجينات المرتبطة بالدورة اللايتيكية. ومع ذلك ، يظهر التنميط أن الجينات المرتبطة بدورة التكرار الليتي يتم قمعها في تعبيرها قبل الحث (على الأقل طيتان لوغاريتم) والتنظيم بعد الاستقراء.
تدعم التحليلات النسخية التي أجريت سابقا لتفاعلات Stx phage مع الإشريكية القولونية فهما شاملا لجينات العاثية المشاركة في الحفاظ على الليزوجيني وإطلاق الدورة lytic11,17. حاليا ، تم شرح عاثيات LES من P. aeruginosa ، لكن وظائفها الجينية الرئيسية أقل فهما جيدا. ستمكن الدراسات النسخية من إعادة شرح نبوءات LES وتحسين فهمنا للجينات المشاركة في دورة lysogeny و lytic. يمثل ربط تسلسل الجينات بالوظيفة تحديا كبيرا في دراسة النبوءات الجديدة ، مما يسلط الضوء بشكل أكبر على الحاجة إلى مزيد من الدراسات لتأكيد وظائف الجينات العاثية لإنتاج أدوات شرح أفضل47. يمكن أن يساعد التطبيق والتكيف الأوسع للبروتوكولات وتدابير مراقبة الجودة الإضافية المفصلة في مقالة الفيديو هذه في الكشف عن وظائف النبوءة المختلفة ، وبالتالي تحسين خطوط أنابيب التعليقات التوضيحية وتحويل فهمنا للعاثيات والبيولوجيا البكتيرية.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |