Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Veteriner aşılaması, hayvancılık sektörünü küresel olarak etkileyen hastalıklara karşı koruma sağlayarak gıda güvenliğinin ve hayvan refahının iyileştirilmesine katkıda bulunduğundan, hayvancılık ve sağlığın çok önemli bir yönünü temsil etmektedir¹. Olası aşı adaylarının immünojenisitesini değerlendirmek için etkili bir in vitro yöntem, aşı geliştirme ve üretim sürecini hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, immün tahliller alanını in vitro çalışmalara dayanan yenilikçi metodolojilerle genişletmek gereklidir, çünkü bu, bağışıklama ve patojen enfeksiyonu ile ilgili bağışıklık süreçlerinin karmaşıklığını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şu anda, periyodik örnekleme gerektiren in vivo hayvan bağışıklaması ve meydan okuma çalışmaları (örneğin, kan ve dalak), aday aşıların ve adjuvanların immünojenisitesini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu tahliller pahalı, zaman alıcı ve etik etkileri vardır, çünkü çoğu durumda hayvan ötenazisi denemelerin sonunda gerçekleştirilir.

İn vivo testlere alternatif olarak, in vitro^2’de aşı kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler) kullanılmıştır. PBMC’ler %70-90 lenfositler, %10-20 monositler ve sınırlı sayıda dendritik hücreden (DC’ler, %1-%2)³ oluşan heterojen bir hücre popülasyonudur. PBMC’ler, B hücreleri, monositler ve DC’ler gibi antijen sunan hücreleri (APC’ler) barındırır ve bunlar enfeksiyon veya doku hasarı belirtileri arayan organizmada sürekli devriye gezer. Lokal olarak salgılanan kemokinler, hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak APC’lerin bu bölgelere alınmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Monositler söz konusu olduğunda, kemokinler kaderlerini DC’lere veya makrofajlara farklılaşmaya^{yönlendirir 4}. DC’ler bir patojenle karşılaşıp yakaladıkları anda, sekonder lenfoid organlara göç ederler, burada işlenmiş patojen peptid antijenlerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II yüzey proteinlerini kullanarak sırasıyla CD8 + T hücrelerine veya CD4 ⁺ T hücrelerine sunabilirler, böylece bir bağışıklık tepkisini tetiklerler ^5,6.

DC’lerin çeşitli patojenlere karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi düzenlemede oynadığı kilit rol, özellikle enfeksiyöz ajanlara karşı aşılar ve adjuvanlar tasarlarken, onları hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için ilginç bir araştırma hedefi haline getirmektedir⁷. PBMC’lerden elde edilebilecek DC’lerin fraksiyonu oldukça küçük olduğundan (% 1 -% 2), bunun yerine in vitro^8’de DC’ler üretmek için monositler kullanılmıştır. Bu monosit türevi DC’ler (MoDC’ler) başlangıçta kanser immünoterapisinde olası bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmiştir⁹. Daha yakın zamanlarda, MoDC’ler aşı araştırmaları için kullanılmıştır^10,11,12 ve klasik monositler MoDC üretimi için baskın alt tiptir (% 89) ¹³. MoDC’lerin in vitro üretimi daha önce interlökin-4 (IL-4), tümör nekroz faktörü α (TNF-α) veya IL-13^14,15,16 gibi diğer sitokinlerle kombinasyon halinde verilen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörün (GM-CSF) eklenmesiyle sağlanmıştır.

Bir in vitro MoDC testinin başarısı, antijenle uyarılmış olgun MoDC’lerin, tespit edilen antijen tipine özgü immün yanıtın kapsamını ve tipini modüle etme kapasitesine dayanır¹⁷. MoDC’ler tarafından tanınan ve sunulan patojen tipi, CD4 ⁺ T yardımcı (Th) hücrelerinin Th1, Th2 veya Th17 efektör hücrelerine farklılaşmasını belirler ve patojene özgü bir sekretuar sitokin profili ile karakterize edilir. Hücre içi patojenlere karşı bir Th1 yanıtı ortaya çıkar ve fagositik bağımlı korumayı modüle eden interferon-gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü beta’nın (TNF-β) salgılanmasıyla sonuçlanır. Paraziter organizmalara karşı bir Th2 yanıtı tetiklenir ve fagositik bağımsız humoral korumayı başlatan IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 sekresyonu ile karakterizedir. Th17, IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ve TNF-18,19,20,21 salgılanmasının aracılık ettiği hücre dışı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı nötrofil bağımlı koruma sağlar α. Önceki çalışmalara dayanarak, tüm patojenlerin beklenen sitokin profiline girmediği belirtilmiştir. Örneğin, dermal MoDC’ler, Leishmania paraziter enfeksiyonuna yanıt olarak, CD4 ⁺ T hücrelerinden ve CD8 ⁺ T hücrelerinden IFN-γ sekresyonunu uyarır, böylece koruyucu bir proinflamatuar Th1 yanıtını indükler²².

Ayrıca, Salmonella lipopolisakkarit (LPS) ile astarlanmış tavuk MoDC’lerinde, hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını aktive ederek Salmonella typhimurium’a karşı değişken bir yanıt indükleyebileceği, oysa Salmonella gallinarum’un tek başına bir Th2 yanıtını indüklediği gösterilmiştir, bu da ikincisinin MoDC klirensi^23’e karşı daha yüksek direncini açıklayabilir. MoDC’lerin Brucella canis’e (B. canis) karşı aktivasyonu hem köpek hem de insan MoDC’lerinde de bildirilmiştir, yani bu zoonotik bir enfeksiyon mekanizmasını temsil edebilir²⁴. B. canis ile astarlanan insan MoDC’leri, şiddetli enfeksiyona direnç kazandıran güçlü bir Th1 yanıtını indüklerken, köpek MoDC’leri, azaltılmış bir Th1 yanıtı ile baskın bir Th17 yanıtını indükler ve daha sonra kronik enfeksiyonun kurulmasına yol açar²⁵. Sığır MoDC’leri, immünoglobulin G (IgG) ile konjuge edilmiş ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) için, tek başına konjuge olmayan FMDV’ye kıyasla gelişmiş bir afinite gösterir, çünkü MoDC’ler önceki^10’a yanıt olarak bir viral-antikor kompleksi oluşturur. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MoDC’lerin patojen enfeksiyonu sırasında bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını analiz etmek için nasıl kullanıldığını göstermektedir. Adaptif immün yanıtlar, lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin nicelleştirilmesi ile değerlendirilebilir. Sadece bölünen hücrelerde tespit edilen hücre içi bir protein olan Ki-67, proliferasyon çalışmaları için güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir 26 ve benzer şekilde, aktivasyonun geç fazı sırasında T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen CD25, lenfosit proliferasyonuna^{karşılık gelir 27,28}.

Bu çalışma, sığır MoDC’lerinin in vitro jenerasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem ve ardından aşıların immünojenisitesini test etmek için kullanılan in vitro immün tahlilde uygulanmasını göstermektedir. Bu tahlilin etkinliğini doğrulamak için ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı (RV) kullanılmıştır. T lenfosit aktivasyonu ve proliferasyonu, Ki-67 ve CD25 gibi iyi bilinen hücre aktivasyon belirteçlerinin analizi ve IFN-γ^28,29,30,31 sekresyonu yoluyla akım sitometrisi^, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü. MoDC testi sırasında hiçbir hayvan veya insan deney denemesi yapılmaz.