Определение иммуногенности вакцины с использованием дендритных клеток, полученных из моноцитов крупного рогатого скота

Ветеринарная вакцинация представляет собой важнейший аспект животноводства и здравоохранения, поскольку она способствует повышению продовольственной безопасности и благополучия животных, обеспечивая защиту от болезней, поражающих животноводческий сектор во всем мире¹. Эффективный метод in vitro для оценки иммуногенности возможных вакцин-кандидатов поможет ускорить процесс разработки и производства вакцины. Поэтому необходимо расширить область иммунных анализов инновационными методологиями, основанными на исследованиях in vitro , поскольку это поможет раскрыть сложность иммунных процессов, связанных с иммунизацией и патогенной инфекцией. В настоящее время для измерения иммуногенности вакцин-кандидатов и адъювантов используются иммунизация животных in vivo , которые требуют периодического отбора проб (например, крови и селезенки). Эти анализы являются дорогостоящими, трудоемкими и имеют этические последствия, потому что в большинстве случаев эвтаназия животных проводится к концу испытаний.

В качестве альтернативы анализам in vivo мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) использовались для оценки иммунных реакций, индуцированных вакциной, in vitro². PBMC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из 70-90% лимфоцитов, 10-20% моноцитов и ограниченного числа дендритных клеток (DC, 1-2%)³. PBMC содержат антигенпрезентирующие клетки (APC), такие как В-клетки, моноциты и ДК, которые постоянно патрулируют организм в поисках признаков инфекции или повреждения тканей. Локально секретируемые хемокины облегчают рекрутирование и активацию APC в этих участках путем связывания с рецепторами клеточной поверхности. В случае моноцитов хемокины направляют свою судьбу либо на дифференцировку в ДК, либо на макрофаги⁴. Как только ДК сталкиваются с патогеном и захватывают его, они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где они могут представить обработанные пептидные антигены патогена с использованием поверхностных белков основного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или класса II CD8+ Т-клеткам CD8+ или CD4⁺ Т-клеткам, соответственно, вызывая иммунный ответ ^5,6.

Ключевая роль, которую играют ДК в организации защитного иммунного ответа против различных патогенов, делает их интересной исследовательской мишенью для понимания внутриклеточных иммунных механизмов, особенно при разработке вакцин и адъювантов против инфекционных агентов⁷. Поскольку доля ДК, которые могут быть получены из PBMC, довольно мала (1% -2%), моноциты вместо этого использовались для генерации ДК in vitro⁸. Эти моноцитарные ДК (MoDC) были первоначально разработаны в качестве возможной стратегии лечения в иммунотерапии рака⁹. Совсем недавно MoDC использовались для исследований вакцин 10,11,12^, а классические моноциты являются преобладающим подтипом (89%) для производства MoDC ¹³. Продуцирование MoDC in vitro ранее достигалось путем добавления гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вводимого в сочетании с другими цитокинами, такими как интерлейкин-4 (IL-4), фактор некроза опухоли α (TNF-α) или IL-13^14,15,16.

Успех анализа MoDC in vitro зависит от способности стимулированных антигеном зрелых MoDC модулировать степень и тип иммунного ответа, специфичного для типа обнаруженного антигена¹⁷. Тип патогена, распознаваемый и представленный MoDC, определяет дифференцировку CD4⁺ Т-хелперных (Th) клеток в эффекторные клетки Th1, Th2 или Th17 и характеризуется патоген-специфическим секреторным цитокиновым профилем. Ответ Th1 вызывается против внутриклеточных патогенов и приводит к секреции интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли бета (ФНО-β), который модулирует фагоцитарно-зависимую защиту. Ответ Th2 запускается против паразитических организмов и характеризуется секрецией IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, которая инициирует фагоцитарно-независимую гуморальную защиту. Th17 обеспечивает нейтрофил-зависимую защиту от внеклеточных бактериальных и грибковых инфекций, опосредованных секрецией IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 и TNF-α 18,19,20,21. Основываясь на предыдущих исследованиях, было отмечено, что не все патогены попадают в ожидаемый цитокиновый профиль. Например, кожные МДК в ответ на паразитарную инфекцию лейшмании стимулируют секрецию ИФН-γ из CD4+ Т-клеток и CD8⁺ Т-клеток, тем самым индуцируя защитный провоспалительный ответ Th1²².

Также было показано, что у куриных МДК, заправленных липополисахаридом сальмонеллы (ЛПС), может индуцировать переменный ответ против Salmonella typhimurium, активируя как Th1, так и Th2 ответы, тогда как Salmonella gallinarum индуцирует только ответ Th2, что может объяснить более высокую резистентность последних к клиренсу^{MoDC 23}. Активация MoDC против Brucella canis (B. canis) также была зарегистрирована как у собак, так и у человека, что означает, что это может представлять собой механизм зоонозной инфекции²⁴. MoDC человека, примированные B. canis, индуцируют сильный ответ Th1, который придает устойчивость к тяжелой инфекции, тогда как MoDC собак индуцируют доминирующий ответ Th17 со сниженным ответом Th1, что впоследствии приводит к установлению хронической инфекции²⁵. MoDC крупного рогатого скота демонстрируют повышенное сродство к вирусу ящура (FMDV), конъюгированному с иммуноглобулином G (IgG), по сравнению с одним неконъюгированным ящуром, поскольку MoDC образуют комплекс вирус-антитело в ответ на первые¹⁰. Взятые вместе, эти исследования показывают, как MoDC использовались для анализа сложности иммунных реакций во время патогенной инфекции. Адаптивные иммунные реакции могут быть оценены путем количественного определения специфических маркеров, связанных с пролиферацией лимфоцитов. Ki-67, внутриклеточный белок, обнаруживаемый только в делящихся клетках, рассматривается как надежный маркер для исследований пролиферации²⁶, и аналогичным образом CD25, экспрессируемый на поверхности Т-клеток во время поздней фазы активации, соответствует пролиферации лимфоцитов^27,28.

В этом исследовании демонстрируется стандартизированный метод получения МДК крупного рогатого скота in vitro с последующим их применением в иммуноанализе in vitro, используемом для тестирования иммуногенности вакцин. Коммерчески доступная вакцина против бешенства (RV) использовалась для подтверждения эффективности этого анализа. Активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов измеряли с помощью проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) путем анализа хорошо известных маркеров активации клеток, таких как Ki-67 и CD25, и секреции ИФН-γ 28,29,30,31. Во время анализа MoDC экспериментальные испытания на животных или людях не проводятся.