兽医疫苗接种是畜牧业和健康的一个重要方面，因为它通过提供保护，防止影响全球畜牧业的疾病，有助于改善粮食安全和动物福利¹。评估可能候选疫苗的免疫原性的有效体 外 方法将有助于加速疫苗的开发和生产过程。因此，有必要通过基于 体外 研究的创新方法来扩展免疫测定领域，因为这将有助于揭示与免疫和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前，需要定期取样（例如血液和脾脏）的 体内 动物免疫和激发研究用于测量候选疫苗和佐剂的免疫原性。这些检测昂贵、耗时且具有伦理意义，因为在大多数情况下，动物安乐死是在试验结束时进行的。

作为体内测定的替代方法，外周血单核细胞（PBMC）已被用于评估疫苗诱导的体外免疫反应²。PBMC是由70%-90%的淋巴细胞，10%-20%的单核细胞和有限数量的树突状细胞（DC，1%-^{2%）组成的}异质细胞群3。PBMC含有抗原呈递细胞（APC），例如B细胞，单核细胞和DC，它们不断巡逻生物体，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs在这些位点的募集和激活。在单核细胞的情况下，趋化因子引导它们的命运分化成DC或巨噬细胞⁴。一旦DC遇到并捕获病原体，它们就会迁移到次级淋巴器官，在那里它们可以分别使用主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工过的病原体肽抗原呈递到CD8 + T细胞或CD4 ⁺ T细胞，从而触发免疫反应^5，6。

DC在协调针对各种病原体的保护性免疫应答中发挥的关键作用使其成为了解细胞内免疫机制的有趣研究目标，特别是在设计针对^{感染因子的}疫苗和佐剂时7。由于可以从PBMC获得的DC比例相当小（1%-2%），因此单核细胞已被用于体外产生^DC。这些单核细胞衍生的DC（MoDC）最初是作为癌症免疫治疗中可能的治疗策略开发的⁹。最近，MoDC已被用于疫苗研究10，¹¹，12^，经典单核细胞是MoDC生产的主要亚型（89%）¹³。MoDCs的体外生产以前是通过添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-13^14，15，¹⁶）联合给药来实现的。

体外MoDC测定的成功依赖于抗原刺激的成熟MoDC调节特定于检测到的抗原类型的免疫反应的程度和类型的能力¹⁷。MoDCs识别和呈递的病原体类型决定了CD4⁺ T辅助（Th）细胞分化为Th1，Th2或Th17效应细胞，并且以病原体特异性分泌细胞因子谱为特征。针对细胞内病原体引发Th1反应，并导致干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子β（TNF-β）的分泌，后者调节吞噬细胞依赖性保护。针对寄生生物触发 Th2 反应，其特征在于 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 分泌，从而启动吞噬细胞非依赖性体液保护。Th17 提供中性粒细胞依赖性保护，防止由分泌 IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22 和 TNF-α^18、19、^20、21 介导的细胞外细菌和真菌感染。根据以前的研究，已经注意到并非所有病原体都属于预期的细胞因子谱。例如，皮肤MoDCs响应利什曼原虫寄生虫感染，刺激CD4 + T细胞和CD8 ⁺ T细胞分泌IFN-γ，从而诱导保护性促炎Th1反应²²。

研究还表明，在用沙门氏菌脂多糖（LPS）引发的鸡MoDC中，可以通过激活Th1和Th2反应来诱导对鼠伤寒沙门氏菌的可变反应，而加里纳鲁沙门氏菌单独诱导Th2反应，这可以解释后者对MoDC清除率的更高抵抗力²³。在犬和人类MoDC中也报道了针对犬布鲁氏菌（B. canis）的MoDCs的激活，这意味着这可能代表人畜共患感染机制²⁴。用犬双歧杆菌引发的人类MoDC诱导强烈的Th1反应，赋予对严重感染的抵抗力，而犬MoDC诱导显性Th17反应，Th1反应降低，随后导致慢性感染的建立²⁵。与单独使用非结合的口蹄疫病毒相比，牛 MoDC 对与免疫球蛋白 G （IgG） 偶联的口蹄疫病毒 （FMDV） 的亲和力增强，因为 MoDC 形成病毒抗体复合物以响应前¹⁰ 种病毒抗体复合物。综上所述，这些研究显示了MoDC如何用于分析病原体感染期间免疫反应的复杂性。适应性免疫应答可以通过量化与淋巴细胞增殖相关的特定标志物来评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的细胞内蛋白，被认为是增殖研究的可靠标志物²⁶，同样，在活化后期在T细胞表面表达的CD25对应于淋巴细胞增殖^27，28。

本研究展示了一种用于体外产生牛MoDC的标准化方法，然后将其应用于用于测试疫苗免疫原性的体外免疫测定中。市售狂犬病疫苗（RV）用于验证该测定的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定T淋巴细胞活化和增殖，分析成熟的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ²⁸，^29，30，31的分泌。在MoDC测定期间不进行动物或人体实验试验。