La microscopia dinamica differenziale (DDM) combina caratteristiche di diffusione dinamica della luce e microscopia. Qui, viene presentato il processo di utilizzo del DDM per caratterizzare le reti citoscheletriche ricostituite quantificando la dinamica subdiffusiva e ingabbiata delle particelle nelle reti di vimentine e il movimento balistico dei compositi actina-microtubulo attivi guidati dalla miosina.
Le cellule possono strisciare, auto-guarire e sintonizzare la loro rigidità a causa del loro citoscheletro notevolmente dinamico. Pertanto, la ricostituzione di reti di biopolimeri citoscheletrici può portare a una serie di materiali attivi e adattabili. Tuttavia, l’ingegneria di tali materiali con proprietà sintonizzate con precisione richiede la misurazione di come le dinamiche dipendano dalla composizione della rete e dai metodi di sintesi. La quantificazione di tali dinamiche è messa in discussione dalle variazioni nel tempo, nello spazio e nello spazio di formulazione delle reti composite. Il protocollo qui descrive come la tecnica di analisi di Fourier, la microscopia dinamica differenziale (DDM), possa quantificare la dinamica delle reti di biopolimeri ed è particolarmente adatta per gli studi di reti di citoscheletri. DDM lavora su sequenze temporali di immagini acquisite utilizzando una gamma di modalità di microscopia, tra cui confocale a scansione laser, fluorescenza a campo largo e imaging a campo luminoso. Da tali sequenze di immagini, si possono estrarre tempi di decorrelazione caratteristici delle fluttuazioni di densità attraverso un arco di vettori d’onda. Viene inoltre sviluppato un pacchetto Python open source user-friendly per eseguire analisi DDM. Con questo pacchetto, si può misurare la dinamica dei componenti del citoscheletro etichettati o delle particelle traccianti incorporate, come dimostrato qui con i dati delle reti di filamenti intermedi (vimentina) e delle reti attive di actina-microtubulo. Gli utenti senza precedenti esperienze di programmazione o di elaborazione delle immagini saranno in grado di eseguire DDM utilizzando questo pacchetto software e la documentazione associata.
Il citoscheletro è una rete di filamenti proteici che si estende attraverso il citoplasma delle cellule eucariotiche, collegando la superficie cellulare al nucleo. Ha proprietà uniche del materiale, fornendo protezione meccanica contro carichi meccanici grandi e ripetuti, ma anche guidando cambiamenti dinamici della forma della cella1. Le reti di citoscheletri ricostituite possono dare origine a una serie di interessanti comportamenti dinamici, dall’ingabbiamento di particelle incorporate al movimento balistico guidato da motori molecolari 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . I metodi per analizzare la dinamica di tali reti includono il monitoraggio del movimento delle microsfere traccianti incorporate 6,7,12,13,14, l’analisi delle immagini per tracciare le dimensioni degli ammassi densi di proteine nel tempo 8, la diffusione dinamica della luce15, la velocimetria dell’immagine delle particelle 4,16,17,18,19 , calcolando la densità spettrale di potenza delle immagini nel tempo19 e l’analisi del kymograph20. Man mano che vengono condotti ulteriori studi sulle reti di citoscheletri ricostituiti, sia per comprendere la meccanica cellulare o la materia attiva, sono sempre più necessari metodi robusti, imparziali e riproducibili per caratterizzare la dinamica. La microscopia dinamica differenziale (DDM)21,22, una tecnica relativamente nuova che è stata utilizzata per studiare la dinamica del citoscheletro, è una di queste tecniche che quantifica in modo efficiente la dinamica con pochi parametri definiti dall’utente. Con il pacchetto software qui descritto, i ricercatori con poca esperienza nella programmazione o nell’analisi delle immagini saranno in grado di sfruttare DDM per il proprio lavoro.
DDM è una tecnica di analisi delle immagini per estrarre la dinamica di un campione. Come il tracciamento delle particelle o la velocimetria delle immagini delle particelle, il DDM richiede una serie temporale di immagini (spesso migliaia di immagini), in genere registrate con un microscopio. A differenza del tracciamento delle particelle, le singole caratteristiche o le perle traccianti non devono essere localizzate (o addirittura localizzabili) nell’immagine. A differenza sia del tracciamento delle particelle che della velocimetria dell’immagine delle particelle, si recupera la dinamica dell’insieme con DDM con relativamente pochi parametri specificati dall’utente. Con DDM, le immagini vengono analizzate nello spazio di Fourier per determinare il tempo di decadimento delle fluttuazioni di densità su un intervallo di numeri d’onda, q, dove q = 2πu e u è la grandezza delle frequenze spaziali, . Si ottengono informazioni simili a scattering ma con immagini nello spazio reale acquisite al microscopio 21,22,23. Pertanto, si possono sfruttare i vari metodi di microscopia che generano contrasto, come la fluorescenza a campo largo22,24, la fluorescenza confocale25, polarizzata26, il campo oscuro27 o la fluorescenza a foglio di luce28 microscopie. Inoltre, le immagini utilizzate per l’analisi DDM possono essere utilizzate per il tracciamento delle particelle o la velocimetria delle immagini delle particelle per fornire informazioni complementari.
Questa combinazione di caratteristiche della diffusione dinamica della luce e della microscopia ottica rende il DDM una tecnica potente e versatile. Dalla sua prima descrizione da parte di Cerbino e Trappe nel 200821, dove DDM è stato dimostrato per misurare la diffusione di particelle colloidali a 73 nm, DDM è stato utilizzato per misurare colloidi fluenti29, aggregazione colloidale 30,31, la viscoelasticità dei cristalli liquidi nematici26, la dinamica dei gel colloidali32, schiume grossolane33, nanoparticelle in ambienti confinati 34, 35,36,37, motilità batterica 38,39,40,41, diffusione di cluster proteici debolmente scattering42, onde capillari a interfacce fluide43 e altri sistemi. Coloro che cercano un elenco più completo delle pubblicazioni che utilizzano DDM possono fare riferimento a documenti di revisione approfonditi sull’argomento 22,23,44,45.
DDM è stato utilizzato anche per studiare la dinamica delle reti biologiche. Drechsler et al. hanno usato DDM per misurare la dinamica dell’actina negli ovociti viventi di Drosophila 46. Burla et al. hanno quantificato la dinamica delle particelle traccianti in reti di compositi ialuronan e ialuronan-collagene47. Sono stati documentati anche diversi usi del DDM per studiare la dinamica delle particelle traccianti nelle reti citoscheletriche ricostituite 9,10, il trasporto di molecole di DNA in tali reti 48,49 e la dinamica delle reti ricostituite attive 11,50,51. Un vantaggio del DDM nella misurazione della dinamica in tali sistemi è che le singole particelle o molecole non devono essere localizzate e tracciate. Quindi, ad esempio, la dinamica delle molecole di DNA in ambienti affollati può essere misurata con DDM nonostante la difficoltà nel tracciare molecole così piccole e non sferiche. Inoltre, con la microscopia a fluorescenza, è possibile utilizzare l’etichettatura multicolore per misurare selettivamente la dinamica dei singoli costituenti in un composito complesso.
Per eseguire DDM, viene acquisita una sequenza di immagini nel tempo, I(x,y,t). Per un dato tempo di ritardo, Δt, si trovano tutte (o un sottoinsieme di) coppie di immagini separate da quel tempo di ritardo. La trasformata di Fourier al quadrato della differenza di ogni coppia,
è calcolato e mediato insieme. Questa quantità, , è media radialmente, a condizione che le dinamiche siano isotrope. In questo modo viene prodotta la matrice DDM (nota anche come funzione di struttura dell’immagine), . Questo processo è illustrato graficamente nella Figura 1. Per determinare la dinamica del campione da questa matrice DDM, si presume che la matrice DDM assuma la forma
dove A è l’ampiezza, che dipende dai dettagli del microscopio e dalla struttura del campione, B è lo sfondo, che dipende dal rumore nelle immagini, e f (q, Δt) è la funzione di scattering intermedio (ISF), che contiene informazioni sulladinamica 21,22. In casi semplici,
dove τ è un tempo caratteristico di decadimento o decorrelazione. Tale ISF è stato utilizzato in diversi studi che impiegano DDM su sistemi ergodici come sospensioni colloidali diluite 21,24,27,37,40,52. Tuttavia, altre forme di ISF possono essere utilizzate per modellare vari tipi di dinamiche. Ad esempio, si può utilizzare un’espansione cumulativa per modellare l’ISF per i campioni polidispersi come
dove μ è una misura della polidispersità42,53; Se le fluttuazioni di densità decadono di due modi separati, si può usare un ISF come
26, 54, 55, 56, 57;
altri ISF possono essere utilizzati per il nuoto di microrganismi o altre particelle attive 38,39,40,41,58,59.
Figura 1: Panoramica dell’analisi DDM. Dalla serie temporale di immagini, la trasformata di Fourier delle differenze di immagine viene calcolata per calcolare la matrice DDM. La matrice DDM può essere adattata a un modello per determinare la scala temporale delle fluttuazioni di densità in un intervallo di valori q . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Qui, viene descritto l’uso di un pacchetto software di analisi DDM sviluppato in Python, PyDDM. Questo pacchetto software si basa sul lavoro svolto dai nostri laboratori di ricerca e da altri studi pubblicati negli ultimi anni. I principali motivatori per la creazione di questo pacchetto software includono la necessità di (1) tenere traccia e archiviare i metadati e i parametri utilizzati nell’analisi; (2) documentazione approfondita con esempi dettagliati di analisi dall’inizio alla fine; e (3) un modo semplice per impiegare diversi (o creare nuovi) modelli matematici per adattare i dati (ad esempio, l’aggiunta di modelli ISF, come quelli recentemente sviluppati per i filamenti attivi60, sarebbe semplice). Esistono anche altri pacchetti software per l’analisi DDM, anche se non tutti sono ben documentati e scritti in un linguaggio di programmazione open source. Ad esempio, esiste codice C++ con calcolo su GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, codice C++ che utilizza le trasformazioni di Fourier nel tempo per accelerare i calcoli (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, matlab e versioni Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, codice MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 e codice MATLAB con quantificazione dell’incertezza ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Poiché questo pacchetto PyDDM è ben documentato e offre molta flessibilità nel modo in cui la matrice DDM viene calcolata e analizzata, si spera che possa essere utile ai ricercatori che desiderano implementare DDM indipendentemente dal loro background nella programmazione o nell’analisi delle immagini.
Il protocollo mostra come questo pacchetto software può essere utilizzato per quantificare la dinamica delle reti di citoscheletri ricostituite in vitro . Questo viene fatto utilizzando due distinti set di dati di imaging: (1) immagini di particelle traccianti submicroniche incorporate in una rete di vimentine prese con microscopia a campo luminoso e (2) immagini di filamenti di actina e microtubuli marcati fluorescentemente in una rete composita entangled con attività guidata dalla miosina presa con microscopia confocale a scansione laser. Le analisi di questi due set di dati evidenziano notevoli punti di forza del DDM, inclusa la sua capacità di analizzare le immagini scattate con una varietà di modalità di imaging (ad esempio, campo luminoso o fluorescenza confocale), di estrarre dinamiche da traccianti incorporati o da filamenti etichettati e di quantificare una varietà di dinamiche (ad esempio, subdiffusive e vincolate o balistiche).
Il pacchetto software qui descritto utilizza DDM per analizzare le fluttuazioni di densità osservate nelle immagini acquisite utilizzando un microscopio ottico. Sono stati mostrati per la prima volta i risultati rappresentativi dei dati delle particelle traccianti incorporate nelle reti di vimentine. L’analisi di tali dati può essere utilizzata per caratterizzare la dimensione e la rigidità delle maglie della rete in modo simile a come il tracciamento delle singole particelle è stato utilizzato in molti studi precedenti sulle reti di citoscheletri 6,12,13. Un vantaggio dell’utilizzo di DDM rispetto al tracciamento di singole particelle è che DDM non richiede la localizzazione delle particelle. Pertanto, anche nelle immagini in cui la densità delle particelle è troppo alta o le particelle troppo piccole per localizzarsi e tracciare, DDM può ancora determinare la dinamica. Dove il tracciamento di singole particelle sarebbe vantaggioso è quando si ispeziona la variabilità da particella a particella. Con DDM, si trova la dinamica media dell’insieme mentre, con il tracciamento di singole particelle, si può calcolare sia l’MSD di una singola particella che il MSD medio dell’insieme. Tuttavia, DDM può essere utilizzato per studiare dinamiche eterogenee analizzando più regioni di interesse all’interno di un ampio campo visivo.
Successivamente, sono stati mostrati i risultati rappresentativi dei dati dei filamenti marcati fluorescentemente in una rete attiva composta da due tipi di filamenti citoscheletrici marcati in modo diverso11. Con questi dati, il movimento balistico è stato caratterizzato senza bisogno di alcuna caratteristica localizzabile all’interno dell’immagine. Poiché DDM estrae la dinamica media dell’insieme con pochi input dell’utente, rende semplice il confronto di serie di immagini acquisite con condizioni diverse (ad esempio, confrontando campioni con diversi rapporti di actina a microtubuli o campioni con diverse concentrazioni di miosina, come fatto in50). Inoltre, utilizzando l’imaging fluorescente, possiamo studiare le dinamiche di diversi componenti di una rete utilizzando l’etichettatura multicolore. Questo è stato fatto in11,50, dove la dinamica dell’actina e dei microtubuli è stata analizzata separatamente in una rete composita attiva actina-microtubulo utilizzando l’imaging multicolore. Nella sezione dei risultati rappresentativi qui, sono stati mostrati solo i risultati del canale dei microtubuli, ma nel lavoro precedente abbiamo confrontato la dinamica dei filamenti di microtubuli e actina11.
Notiamo che questi risultati rappresentativi mostrano una sottodiffusione passiva o un movimento balistico attivo. È importante sottolineare che DDM può essere utilizzato per analizzare sistemi in cui vi è un crossover nel tipo di dinamica a scale di tempo o lunghezza intermedie. Come esempi, Kurzthaler et al. hanno usato DDM con un sistema di colloidi Janus attivi per esplorare il movimento diretto attivo su scale temporali brevi e la randomizzazione dell’orientamento su scale temporali più lunghe59; Giavazzi et al. hanno usato DDM con una schiuma grossolana e hanno trovato un crossover nella dinamica corrispondente alla scala di lunghezza di una bolla33; e Cho et al. hanno usato DDM con gel colloidali e hanno trovato tre regimi distinguibili a diverse scale di lunghezza che vanno dai cluster frattali all’intera rete32.
I dati inclusi nella sezione dei risultati rappresentativi sono stati acquisiti con microscopia a campo luminoso e microscopia confocale a scansione laser. Tuttavia, come notato in precedenza, DDM può essere utilizzato con molte modalità di imaging. Con qualsiasi modalità di imaging, gli utenti dovrebbero considerare le impostazioni ottiche come il grado di sezionamento ottico o la profondità di campo. Un alto grado di sezionamento ottico può ridurre il segnale da oggetti fuori fuoco, ma non si sarà in grado di misurare con precisione la dinamica su scale temporali superiori alla scala temporale in cui gli oggetti si spostano fuori dalla profondità di campo25,28. Una discussione più approfondita di come la profondità di campo q-dipendente influisce sull’analisi DDM può essere trovata in22. Per l’imaging a campo luminoso, gli utenti potrebbero anche dover considerare lo spessore del campione. Mentre per i campioni a dispersione debole, i campioni più spessi possono fornire più segnale42, i campioni torbidi possono richiedere la modifica dell’analisi per tenere conto dello scattering multiplo81. Infine, per i metodi di imaging che non sono invarianti dello spazio lineare (cioè, dove l’intensità registrata dalla telecamera di un oggetto dipende da dove si trova quell’oggetto nel piano del campione x-y), potrebbe essere necessario tenere conto della varianza dello spazio lineare, come dimostrato con il campo oscuro DDM27.
Per coloro che iniziano con DDM, desideriamo sottolineare l’importanza di considerare la risoluzione spaziale e temporale. Quando si ispezionano i tempi di decadimento determinati in funzione del numero d’onda, è importante contrassegnare i limiti della propria risoluzione (cioè i tempi di ritardo massimo e minimo e il numero d’onda massimo, come fatto nella Figura 5). Si dovrebbe riflettere attentamente su questi limiti prima di raccogliere dati in modo da poter selezionare l’obiettivo obiettivo ottimale, le dimensioni dell’immagine, la frequenza dei fotogrammi e la durata del filmato. L’altra considerazione importante è come stimare il parametro di sfondo B. In letteratura sono stati utilizzati diversi metodi per stimare il background e gli effetti della sovrastima o della sottostima di B sono stati descritti in precedenti pubblicazioni62,77. Come mostrato nella Figura 10, PyDDM consente agli utenti di implementare diversi metodi per stimare B e suggeriamo ai nuovi utenti di provare questi metodi e valutare quali sono appropriati da usare.
Un punto di forza di questo pacchetto è la sua documentazione approfondita e le procedure dettagliate con dati di esempio, l’archiviazione e l’organizzazione dei metadati per tenere traccia di come sono state eseguite le analisi e la flessibilità su come analizzare la matrice DDM (vari modelli di raccordo, più metodi per stimare il parametro di sfondo B, la capacità di trovare il MSD). Tuttavia, ci sono diversi aspetti di questo codice che potrebbero essere migliorati. Attualmente, il codice non è stato ottimizzato per una velocità di calcolo elevata. I metodi per accelerare il calcolo sono stati segnalati61,62 e questi saranno implementati nelle versioni future. Inoltre, abbiamo in programma di implementare metodi recentemente riportati per stimare meglio le incertezze e impiegare simulazioni per guidare gli utenti verso il modello ISF62 appropriato. Per altri miglioramenti, speriamo che gli utenti ci contatteranno con suggerimenti.
The authors have nothing to disclose.
Parti di questa ricerca sono state finanziate da un National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, assegnato a R.M.R.-A. e R.J.M.), un Cottrell Scholar Award dalla Research Corporation for Science Advancement (premio n. 27459, assegnato a R.J.M.), e un William M. Keck Foundation Research Grant (assegnato a R.M.R-A.). GHK riconosce con gratitudine il sostegno finanziario del Dutch Research Council (NWO; numero di progetto VI.C.182.004 del NWO Talent Programme).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |