Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.
Cellen kunnen kruipen, zichzelf genezen en hun stijfheid afstemmen vanwege hun opmerkelijk dynamische cytoskelet. Als zodanig kunnen reconstituerende netwerken van cytoskeletale biopolymeren leiden tot een groot aantal actieve en aanpasbare materialen. Het ontwerpen van dergelijke materialen met nauwkeurig afgestemde eigenschappen vereist echter het meten van hoe de dynamiek afhankelijk is van de netwerksamenstelling en synthesemethoden. Het kwantificeren van een dergelijke dynamiek wordt uitgedaagd door variaties in de tijd, ruimte en formuleringsruimte van samengestelde netwerken. Het protocol beschrijft hier hoe de Fourier-analysetechniek, differentiële dynamische microscopie (DDM), de dynamiek van biopolymeernetwerken kan kwantificeren en bijzonder geschikt is voor studies van cytoskeletnetwerken. DDM werkt aan tijdreeksen van beelden die zijn verkregen met behulp van een reeks microscopiemodaliteiten, waaronder laserscanning confocale, widefield-fluorescentie en brightfield-beeldvorming. Uit dergelijke beeldsequenties kan men karakteristieke decorrelatietijden van dichtheidsfluctuaties over een reeks golfvectoren extraheren. Er wordt ook een gebruiksvriendelijk, open-source Python-pakket ontwikkeld om DDM-analyses uit te voeren. Met dit pakket kan men de dynamiek van gelabelde cytoskeletcomponenten of van ingebedde tracerdeeltjes meten, zoals hier gedemonstreerd met gegevens van intermediaire filament (vimentine) netwerken en actieve actine-microtubule netwerken. Gebruikers zonder eerdere programmeer- of beeldverwerkingservaring kunnen DDM uitvoeren met behulp van dit softwarepakket en de bijbehorende documentatie.
Het cytoskelet is een netwerk van eiwitfilamenten dat zich uitstrekt over het cytoplasma van eukaryote cellen en het celoppervlak verbindt met de kern. Het heeft unieke materiaaleigenschappen, biedt mechanische bescherming tegen grote en herhaalde mechanische belastingen, maar drijft ook dynamische celvormveranderingenaan 1. Gereconstitueerde cytoskeletnetwerken kunnen aanleiding geven tot een reeks interessante dynamische gedragingen, van het opsluiten van ingebedde deeltjes tot ballistische bewegingen aangedreven door moleculaire motoren 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Methoden om de dynamiek van dergelijke netwerken te analyseren omvatten het volgen van de beweging van ingebedde tracermicrosferen 6,7,12,13,14, beeldanalyse om de grootte van eiwitdichte clusters in de loop van de tijd te volgen 8, dynamische lichtverstrooiing15, deeltjesbeeld velocimetrie 4,16,17,18,19 , waarbij de spectrale vermogensdichtheid van beelden in de loop van de tijdwordt berekend 19, en kymograafanalyse20. Naarmate er meer studies naar gereconstitueerde cytoskeletnetwerken worden uitgevoerd, of het nu gaat om het begrijpen van cellulaire mechanica of actieve materie, worden robuuste, onbevooroordeelde en reproduceerbare methoden voor het karakteriseren van de dynamiek steeds noodzakelijker. Differentiële dynamische microscopie (DDM)21,22, een relatief nieuwe techniek die is gebruikt om cytoskeletdynamica te bestuderen, is zo’n techniek die de dynamica efficiënt kwantificeert met weinig door de gebruiker gedefinieerde parameters. Met het hier beschreven softwarepakket kunnen onderzoekers met weinig ervaring in programmeren of beeldanalyse DDM gebruiken voor hun eigen werk.
DDM is een beeldanalysetechniek om de dynamiek van een monster te extraheren. Net als deeltjestracking of deeltjesbeeld velocimetrie vereist DDM een tijdreeks van afbeeldingen (vaak duizenden afbeeldingen), meestal vastgelegd met een microscoop. In tegenstelling tot het volgen van deeltjes, hoeven individuele kenmerken of tracerparels niet te worden gelokaliseerd (of zelfs gelokaliseerd) in de afbeelding. In tegenstelling tot zowel deeltjestracking als deeltjesbeeld velocimetrie, herstelt men de ensembledynamiek met DDM met relatief weinig door de gebruiker gespecificeerde parameters. Met DDM worden beelden geanalyseerd in de Fourierruimte om de vervaltijd van dichtheidsfluctuaties over een bereik van golfnummers te bepalen, q, waarbij q = 2πu pt u de grootte van de ruimtelijke frequenties is, . Men verstrooiingsachtige informatie, maar met real-space beelden verkregen op een microscoop 21,22,23. Daarom kan men profiteren van de verschillende contrastgenererende methoden van microscopie, zoals widefield fluorescentie22,24, confocale fluorescentie25, gepolariseerde26, donkerveld27 of light-sheet fluorescentie28 microscopieën. Bovendien kunnen afbeeldingen die worden gebruikt voor DDM-analyse worden gebruikt voor het volgen van deeltjes of deeltjesbeeld velocimetrie om aanvullende informatie te verstrekken.
Deze combinatie van kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en optische microscopie maakt DDM een krachtige en veelzijdige techniek. Sinds de eerste beschrijving door Cerbino en Trappe in 200821, waar werd aangetoond dat DDM de diffusie van 73 nm colloïdale deeltjes meet, is DDM gebruikt om stromende colloïden29, colloïdale aggregatie 30,31, de visco-elasticiteit van nematische vloeibare kristallen26, de dynamiek van colloïdale gels32, grofschuim33, nanodeeltjes in besloten omgevingen34, 35,36,37, bacteriële beweeglijkheid 38,39,40,41, de diffusie van zwak verstrooiende eiwitclusters 42, capillaire golven bij vloeistofinterfaces43 en andere systemen. Wie op zoek is naar een completere lijst van publicaties die DDM gebruiken, kan verwijzen naar grondige overzichtsartikelen over het onderwerp 22,23,44,45.
DDM is ook gebruikt om de dynamiek van biologische netwerken te onderzoeken. Drechsler et al. gebruikten DDM om de dynamiek van actine in levende Drosophila-eicellen te meten46. Burla et al. kwantificeerden de dynamiek van tracerdeeltjes in netwerken van hyaluronaat en hyaluronaat-collageencomposieten47. Verschillende toepassingen van DDM om de dynamiek van tracerdeeltjes in gereconstitueerde cytoskeletnetwerken 9,10, het transport van DNA-moleculen in dergelijke netwerken48,49 en de dynamiek van actieve gereconstitueerde netwerken zijn ook gedocumenteerd 11,50,51. Een voordeel van DDM bij het meten van de dynamiek in dergelijke systemen is dat individuele deeltjes of moleculen niet gelokaliseerd en gevolgd hoeven te worden. Zo kan bijvoorbeeld de dynamiek van DNA-moleculen in drukke omgevingen worden gemeten met DDM, ondanks de moeilijkheid om dergelijke kleine en niet-bolvormige moleculen te volgen. Bovendien kan men met fluorescentiemicroscopie multi-color labeling gebruiken om selectief de dynamiek van individuele bestanddelen in een complex composiet te meten.
Om DDM uit te voeren, wordt in de loop van de tijd een reeks afbeeldingen gemaakt, I (x, y, t). Voor een bepaalde vertragingstijd, Δt, worden alle (of een subset van) paren afbeeldingen gevonden, gescheiden door die vertragingstijd. De vierkante Fourier transformeert het verschil van elk paar,
wordt samen berekend en gemiddeld. Deze hoeveelheid, , is radiaal gemiddeld, op voorwaarde dat de dynamiek isotroop is. Dit levert de DDM-matrix op (ook wel de beeldstructuurfunctie genoemd), . Dit proces wordt grafisch weergegeven in figuur 1. Om de dynamiek van het monster uit deze DDM-matrix te bepalen, wordt aangenomen dat de DDM-matrix de vorm aanneemt
waarbij A de amplitude is, die afhankelijk is van de details van de microscoop en de structuur van het monster, B de achtergrond is, die afhankelijk is van de ruis in de beelden, en f (q, Δt) de intermediaire verstrooiingsfunctie (ISF), die informatie bevat over de dynamiek21,22. In eenvoudige gevallen,
waarbij τ een karakteristieke verval- of decorrelatietijd is. Een dergelijke ISF is gebruikt in verschillende studies waarbij DDM wordt gebruikt op ergodische systemen zoals verdunde colloïdale suspensies 21,24,27,37,40,52. Andere vormen van de ISF kunnen echter worden gebruikt om verschillende soorten dynamiek te modelleren. Men kan bijvoorbeeld een cumulante expansie gebruiken om de ISF voor polydispersemonsters te modelleren als
waarbij μ een maat is voor de polydispersiteit42,53; als dichtheidsfluctuaties door twee afzonderlijke modi vervallen, kan men een ISF-achtige gebruiken
26, 54, 55, 56, 57;
andere ISF’s kunnen worden gebruikt voor zwemmende micro-organismen of andere actieve deeltjes 38,39,40,41,58,59.
Figuur 1: Overzicht van DDM-analyse. Uit de tijdreeks van beelden wordt de Fouriertransformatie van beeldverschillen berekend om de DDM-matrix te berekenen. De DDM-matrix kan worden aangepast aan een model om de tijdschaal van dichtheidsfluctuaties over een bereik van q-waarden te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hier wordt het gebruik van een DDM-analysesoftwarepakket ontwikkeld in Python, PyDDM, beschreven. Dit softwarepakket bouwt voort op het werk dat onze onderzoekslaboratoria en andere gepubliceerde studies de afgelopen jaren hebben gedaan. Primaire motivatoren voor het maken van dit softwarepakket zijn de noodzaak om (1) metadata en parameters die bij de analyse worden gebruikt bij te houden en op te slaan; (2) grondige documentatie met gedetailleerde voorbeelden van analyse van begin tot eind; en (3) een eenvoudige manier om verschillende (of nieuwe) wiskundige modellen te gebruiken voor het aanpassen van de gegevens (bijvoorbeeld het toevoegen van ISF-modellen, zoals die onlangs zijn ontwikkeld voor actieve filamenten60, zou eenvoudig zijn). Er bestaan ook andere softwarepakketten voor DDM-analyse, hoewel ze niet allemaal goed gedocumenteerd en geschreven zijn in een open-source programmeertaal. Er is bijvoorbeeld C++ code met computing op GPU’s (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, C++ code die Fouriertransformaties in de tijd gebruikt om berekeningen te versnellen (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB- en Python-versies (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB-code (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 en MATLAB-code met onzekerheidskwantificering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Omdat dit PyDDM-pakket goed gedocumenteerd is en veel flexibiliteit biedt in hoe de DDM-matrix wordt berekend en geanalyseerd, kan het hopelijk nuttig zijn voor onderzoekers die DDM willen implementeren, ongeacht hun achtergrond in programmeren of beeldanalyse.
Het protocol laat zien hoe dit softwarepakket kan worden gebruikt om de dynamiek van in vitro gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te kwantificeren. Dit wordt gedaan met behulp van twee verschillende sets beeldgegevens: (1) beelden van submicron tracerdeeltjes ingebed in een vimentinenetwerk genomen met brightfield-microscopie en (2) beelden van fluorescerend gelabelde actine- en microtubulefilamenten in een verstrengeld composietnetwerk met myosine-gestuurde activiteit genomen met laserscan confocale microscopie. De analyses van deze twee datasets benadrukken opmerkelijke sterke punten van DDM, waaronder het vermogen om beelden te analyseren die zijn gemaakt met een verscheidenheid aan beeldvormingsmodaliteiten (bijv. Brightfield of confocale fluorescentie), om dynamiek te extraheren uit ingebedde tracers of uit gelabelde filamenten, en om een verscheidenheid aan dynamieken te kwantificeren (bijv. Subdiffusief en beperkt of ballistisch).
Het hier beschreven softwarepakket maakt gebruik van DDM om dichtheidsfluctuaties te analyseren die worden waargenomen in beelden die zijn verkregen met behulp van een optische microscoop. Representatieve resultaten van de gegevens van tracerdeeltjes ingebed in vimentinenetwerken werden voor het eerst getoond. De analyse van dergelijke gegevens kan worden gebruikt om de maaswijdte en stijfheid van het netwerk te karakteriseren op dezelfde manier als hoe single-particle tracking is gebruikt in veel eerdere studies van cytoskeletnetwerken 6,12,13. Een voordeel van het gebruik van DDM ten opzichte van single-particle tracking is dat DDM niet vereist dat de deeltjes gelokaliseerd zijn. Daarom kan DDM zelfs in beelden waar de deeltjesdichtheid te hoog is of de deeltjes te klein om te lokaliseren en te volgen, nog steeds de dynamiek bepalen. Waar single-particle tracking voordelig zou zijn, is bij het inspecteren van deeltjes-tot-deeltjesvariabiliteit. Met DDM vindt men de gemiddelde dynamiek van het ensemble, terwijl men met single-particle tracking zowel de MSD van een enkel deeltje als de ensemblegemiddelde MSD kan berekenen. DDM kan echter worden gebruikt om heterogene dynamiek te onderzoeken door meerdere interessegebieden binnen een groot gezichtsveld te analyseren.
Vervolgens werden representatieve resultaten getoond van gegevens van fluorescerend gelabelde filamenten in een actief netwerk bestaande uit twee verschillend gelabelde cytoskeletale filamenttypen11. Met deze gegevens werd de ballistische beweging gekarakteriseerd zonder dat er lokaliseerbare kenmerken in het beeld nodig waren. Omdat DDM de gemiddelde dynamiek van het ensemble extraheert met weinig gebruikersinvoer, maakt het het vergelijken van beeldreeksen verkregen met verschillende omstandigheden eenvoudig (bijvoorbeeld het vergelijken van monsters met verschillende verhoudingen van actine tot microtubuli of monsters met verschillende concentraties myosine, zoals gedaan in50). Bovendien kunnen we met behulp van fluorescerende beeldvorming de dynamiek van verschillende componenten van een netwerk onderzoeken met behulp van multicolor-labeling. Dit werd gedaan in 11,50, waar de dynamiek van actine en van microtubuli afzonderlijk werd geanalyseerd in een actief actine-microtubule composietnetwerk met behulp van multicolor imaging. In de sectie representatieve resultaten hier werden alleen de resultaten van het microtubulekanaal getoond, maar in eerder werk vergeleken we de dynamiek van de microtubule- en actinefilamenten11.
We merken op dat deze representatieve resultaten ofwel passieve subdiffusie of actieve ballistische beweging laten zien. Belangrijk is dat DDM kan worden gebruikt om systemen te analyseren waarbij er een cross-over is in het type dynamiek op tussenliggende tijds- of lengteschalen. Als voorbeelden gebruikten Kurzthaler et al. DDM met een systeem van actieve Januscolloïden om actieve gerichte beweging op korte tijdschalen en randomisatie van de oriëntatie op langere tijdschalente onderzoeken 59; Giavazzi et al. gebruikten DDM met een grof schuim en vonden een cross-over in de dynamiek die overeenkomt met de lengteschaal van een bel33; en Cho et al. gebruikten DDM met colloïdale gels en vonden drie onderscheidbare regimes op verschillende lengteschalen, variërend van de fractalclusters tot het hele netwerk32.
De gegevens in de sectie representatieve resultaten werden verkregen met brightfield-microscopie en laserscanning confocale microscopie. Zoals eerder opgemerkt, kan DDM echter met veel beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt. Bij elke beeldvormingsmodaliteit moeten gebruikers optische instellingen overwegen, zoals de mate van optische sectie of de scherptediepte. Een hoge mate van optische sectioning kan het signaal van onscherpe objecten verminderen, maar men zal niet in staat zijn om de dynamiek nauwkeurig te meten over tijdschalen die groter zijn dan de tijdschaal voor objecten om uit de scherptediepte te bewegen25,28. Een meer grondige bespreking van hoe de q-afhankelijke scherptediepte DDM-analyse beïnvloedt, is te vinden in22. Voor brightfield imaging moeten gebruikers mogelijk ook rekening houden met de dikte van het monster. Terwijl voor zwak verstrooiende monsters dikkere monsters meer signaal42 kunnen leveren, kunnen troebele monsters de analyse moeten aanpassen om rekening te houden met meerdere verstrooiing81. Ten slotte, voor beeldvormingsmethoden die geen lineaire ruimte-invariant zijn (dat wil zeggen, waarbij de intensiteit die door de camera van een object wordt geregistreerd, afhangt van waar dat object zich in het x-y-monstervlak bevindt), moet men mogelijk rekening houden met de lineaire ruimtevariantie, zoals aangetoond met dark-field DDM27.
Voor degenen die aan de slag gaan met DDM, willen we het belang benadrukken van het overwegen van de ruimtelijke en temporele resolutie. Bij het inspecteren van de vastgestelde vervaltijden als functie van het golfnummer, is het belangrijk om de grenzen van iemands resolutie te markeren (d.w.z. de maximale en minimale vertragingstijden en het maximale golfnummer, zoals gedaan in figuur 5). Men moet goed nadenken over deze limieten voordat u gegevens verzamelt, zodat de optimale objectieve lens, beeldgrootte, framesnelheid en filmduur kunnen worden geselecteerd. De andere belangrijke overweging is hoe de achtergrondparameter B moet worden geschat. In de literatuur zijn meerdere methoden gebruikt om de achtergrond te schatten en de effecten van over- of onderschatting van B zijn beschreven in eerdere publicaties62,77. Zoals te zien is in figuur 10, stelt PyDDM gebruikers in staat om verschillende methoden te implementeren voor het schatten van B, en we raden nieuwe gebruikers aan deze methoden te proberen en te evalueren welke geschikt zijn om te gebruiken.
Een kracht van dit pakket is de grondige documentatie en walkthroughs met voorbeeldgegevens, de opslag en organisatie van metadata om bij te houden hoe analyses werden uitgevoerd, en de flexibiliteit in het analyseren van de DDM-matrix (verschillende aanpassingsmodellen, meerdere methoden voor het schatten van de achtergrondparameter B, de mogelijkheid om de MSD te vinden). Er zijn echter meerdere aspecten aan deze code die kunnen worden verbeterd. Momenteel is de code niet geoptimaliseerd voor een snelle rekensnelheid. Methoden voor het versnellen van de berekening zijn gemeld61,62, en deze zullen worden geïmplementeerd in toekomstige releases. Daarnaast zijn we van plan om recent gerapporteerde methoden te implementeren om onzekerheden beter in te schatten en simulaties te gebruiken om gebruikers naar het juiste ISF-model62 te leiden. Voor andere verbeteringen hopen we dat gebruikers contact met ons opnemen met suggesties.
The authors have nothing to disclose.
Delen van dit onderzoek werden gefinancierd door een National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, toegekend aan R.M.R.-A. en R.J.M.), een Cottrell Scholar Award van de Research Corporation for Science Advancement (prijs nr. 27459, toegekend aan R.J.M.), en een William M. Keck Foundation Research Grant (toegekend aan R.M.R-A.). GHK dankt de financiële steun van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO; projectnummer VI.C.182.004 van het NWO-Talentprogramma).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |