Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para generar el labio superior. Al mismo tiempo, la palatogénesis se inicia con la formación de distintas excrecencias, los estantes palatinos secundarios, desde el lado oral de los procesos maxilares en E11.5. Con el tiempo, los estantes palatinos crecen hacia abajo a ambos lados de la lengua, se elevan a una posición opuesta por encima de la lengua y, finalmente, se fusionan en la línea media para formar un paladar continuo que separa las cavidades nasales y orales por E16.5¹.

Estos cambios morfológicos a lo largo del desarrollo craneofacial se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Por ejemplo, los receptores de la membrana celular, como las subfamilias de receptores β del factor de crecimiento transformador (TGF), incluidos los receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR) y varias familias de receptores tirosina quinasa (RTK), se autofosforilan al unirse y activarse en las células de la cresta neural craneal ^2,3,4 . Además, el receptor transmembrana acoplado a la proteína G Smoothened se fosforila en las células de la cresta neural craneal y el ectodermo craneofacial aguas abajo del ligando Sonic Hedgehog (SHH) que se une al receptor Patched1, lo que resulta en una acumulación suavizada en la membrana ciliar y la activación de la vía SHH⁵. Tales interacciones ligando-receptor pueden ocurrir a través de la señalización autocrina, paracrina y / o yuxtacrina en contextos craneofaciales. Por ejemplo, se sabe que BMP6 señala de manera autocrina durante la diferenciación de condrocitos⁶, mientras que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 8 se expresa en el ectodermo del arco faríngeo y se une a los miembros de la familia FGF de RTK expresados en el mesénquima del arco faríngeo de manera paracrina para iniciar el modelado y el crecimiento de los arcos faríngeos^{7, 8,9,10}. Además, la señalización de Notch se activa tanto en condrocitos como en osteoblastos durante el desarrollo esquelético craneofacial a través de la señalización de yuxtacrina cuando los ligandos Transmembrana Delta y/o Jagged se unen a los receptores de Notch transmembrana en las células vecinas, que posteriormente se escindieron y fosforilan¹¹. Sin embargo, hay otros pares de ligandos y receptores importantes para el desarrollo craneofacial que tienen la flexibilidad para funcionar tanto en la señalización autocrina como en la paracrina. Como ejemplo, durante la morfogénesis de los dientes murinos, se ha demostrado que el ligando del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA indica de manera autocrina para activar el RTK PDGFRα en el epitelio¹² del órgano del esmalte. Por el contrario, en los procesos faciales murinos durante la mitad de la gestación, las transcripciones que codifican los ligandos PDGF-AA y PDGF-CC se expresan en el ectodermo craneofacial, mientras que el receptor PDGFRα se expresa en el mesénquima subyacente derivado de la cresta neural craneal, lo que resulta en una señalización paracrina ^{13,14,15,16,17} . Independientemente del mecanismo de señalización, estos eventos de fosforilación del receptor a menudo resultan en el reclutamiento de proteínas adaptadoras y / o moléculas de señalización, que con frecuencia se fosforilan para iniciar cascadas de quinasa intracelular, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)^18,19.

Los efectores intracelulares terminales de estas cascadas pueden fosforilar una serie de sustratos, como factores de transcripción, unión a ARN, proteínas citoesqueléticas y de matriz extracelular. Runx2²⁰, Hand1²¹, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 y Sox9 ²⁶ se encuentran entre los factores de transcripción fosforilados en el contexto del desarrollo craneofacial. Esta modificación post-traduccional (PTM) puede afectar directamente la susceptibilidad a ptM alternativos, dimerización, estabilidad, escisión y/o afinidad de unión al ADN, entre otras actividades 20,21,25,26. Además, la proteína de unión al ARN Srsf3 se fosforila en el contexto del desarrollo craneofacial, lo que lleva a su translocación nuclear²⁷. En general, se ha demostrado que la fosforilación de las proteínas de unión al ARN afecta su localización subcelular, las interacciones proteína-proteína, la unión al ARN y/o la especificidad de la secuencia²⁸. Además, la fosforilación de la actomiosina puede conducir a reordenamientos citoesqueléticos a lo largo del desarrollo craneofacial^29,30, y la fosforilación de proteínas de la matriz extracelular, como las pequeñas glicoproteínas ligadas al ligando a la ligando a integrinas N, contribuye a la biomineralización durante el desarrollo esquelético³¹. A través de lo anterior y muchos otros ejemplos, es evidente que hay amplias implicaciones para la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial. Añadiendo un nivel adicional de regulación, la fosforilación de proteínas es modulada aún más por las fosfatasas, que contrarrestan las quinasas mediante la eliminación de grupos fosfato.

Estos eventos de fosforilación tanto a nivel de molécula receptora como efectora son críticos para la propagación de las vías de señalización y, en última instancia, dan lugar a cambios en la expresión génica en el núcleo, impulsando actividades celulares específicas, como la migración, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación, que resultan en la formación adecuada de la cara del mamífero. Dada la especificidad del contexto de las interacciones de las proteínas con las quinasas y las fosfatasas, los cambios resultantes en los PTM y sus efectos sobre la actividad celular, es fundamental que estos parámetros se estudien en un entorno fisiológicamente relevante para obtener una comprensión completa de la contribución de los eventos de fosforilación al desarrollo craneofacial. Aquí, se proporcionan ejemplos de dos contextos en los que estudiar la fosforilación de proteínas y, por lo tanto, la activación de las vías de señalización durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: los procesos faciales de ratón, en particular los procesos maxilares E11.5, y las células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de E13.5 estantes palatinos secundarios, tanto primarios³² como inmortalizados³³ . En E11.5, los procesos maxilares están en proceso de fusión con los procesos nasales laterales y mediales¹, lo que representa un punto de tiempo crítico durante el desarrollo craneofacial del ratón. Además, los procesos maxilares y las células derivadas de los estantes palatinos se eligieron aquí porque las últimas estructuras son derivadas de las primeras, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de interrogar la fosforilación de proteínas in vivo e in vitro en contextos relacionados. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a procesos faciales alternativos y puntos de tiempo de desarrollo.

Un problema crítico en el estudio de las proteínas fosforiladas es que son fácilmente desfosforiladas durante el aislamiento de proteínas por abundantes fosfatasas ambientales. Para superar esta barrera, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de proteínas fosforiladas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las proteínas fosforiladas. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias vías de señalización activas durante el desarrollo craneofacial.