リンタンパク質分析のためのマウスフェイシャルプロセスおよび培養口蓋間葉系細胞からの全細胞タンパク質溶解物の単離

哺乳類の頭蓋顔面発達は、複数の細胞集団が調整して前頭鼻骨格を生成する複雑な形態学的プロセスである。マウスでは、このプロセスは胚期(E)9.5に始まり、前頭鼻突出部および上顎および下顎突起のペアの形成が起こり、それぞれに回遊後頭蓋神経堤細胞が含まれる。側方および内側の鼻プロセスは、鼻孔の出現を伴う前頭鼻突出部から生じ、最終的に融合して鼻孔を形成する。さらに、内側鼻プロセスと上顎プロセスが融合して上唇を生成する。同時に、口蓋形成は、E11.5で上顎突起の口腔側から明確な外生(二次口蓋棚)の形成によって開始される。時間が経つにつれて、口蓋棚は舌の両側で下方に成長し、舌の上の反対の位置に上昇し、最終的に正中線で融合して、E16.5¹によって鼻腔と口腔を隔てる連続的な口蓋を形成する。

頭蓋顔面発達全体にわたるこれらの形態学的変化は、キナーゼによるタンパク質リン酸化を含むことが多い多様なシグナル伝達相互作用によって開始および維持される。例えば、骨形成タンパク質受容体(BMPR)を含む形質転換成長因子(TGF)β受容体のサブファミリー、および種々の受容体チロシンキナーゼ(RTK)ファミリーなどの細胞膜受容体は、頭蓋神経堤細胞におけるリガンド結合および活性化時に自己リン酸化される^2,3,4。.さらに、平滑化されたGタンパク質共役型膜貫通型受容体は、Patched1受容体に結合するソニックヘッジホッグ(SHH)リガンドの下流の頭蓋神経堤細胞および頭蓋顔面外胚葉においてリン酸化され、毛様体膜およびSHH経路活性化⁵における平滑化蓄積をもたらす。このようなリガンド-受容体相互作用は、頭蓋顔面状況におけるオートクリン、パラクリン、および/またはジュクスタクリンシグナル伝達を介して起こり得る。例えば、BMP6は軟骨細胞分化6中にオートクリン様式でシグナル伝達することが知られており、^{一方、線維}芽細胞増殖因子(FGF)8は咽頭弓外胚葉に発現し、咽頭弓間葉に発現するRTKのFGFファミリーのメンバーにパラクリン様式で結合して咽頭弓⁷のパターニングおよび外生を開始し^、8,9,10。さらに、Notchシグナル伝達は、膜貫通デルタおよび/またはギザギザリガンドが隣接する細胞上の膜貫通Notch受容体に結合し、その後切断およびリン酸化されるときに、傍タクリンシグナル伝達を介して、頭蓋顔面骨格発達中に軟骨細胞および骨芽細胞の両方で活性化される¹¹。しかし、頭蓋顔面発達にとって重要な他のリガンドおよび受容体対は、オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達の両方において機能する柔軟性を有する。一例として、マウス歯の形態形成中に、血小板由来成長因子(PDGF)−AAリガンドがオートクリン様式でシグナル伝達し、エナメル器官上皮¹²中のRTK PDGFRαを活性化することが実証された。対照的に、妊娠中期のマウス顔面突起では、リガンドPDGF-AAおよびPDGF-CCをコードする転写産物が頭蓋顔面外胚葉で発現し、一方、PDGFRα受容体は下層の頭蓋神経堤由来間葉系で発現され、パラクリンシグナル伝達をもたらす13^、14、¹⁵、^16、17.シグナル伝達機構にかかわらず、これらの受容体リン酸化事象は、しばしばアダプタータンパク質および/またはシグナル伝達分子の動員をもたらし、それらはしばしばそれ自体がリン酸化されてマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路などの細胞内キナーゼカスケードを開始する^18,19。

これらのカスケードの末端細胞内エフェクターは、転写因子、RNA結合、細胞骨格および細胞外マトリックスタンパク質などの基質の配列をリン酸化することができる。Runx2²⁰、Hand1 21、Dlx3/5 22、²³、24、^Gli1-3 25^、およびSox9 ²⁶は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化された転写因子の1つである。この翻訳後修飾(PTM)は、他の活性の中でも特に、代替PTMに対する感受性、二量体化、安定性、切断、および/またはDNA結合親和性に直接影響し得る20^、21、^25、26。さらに、RNA結合タンパク質Srsf3は、頭蓋顔面発達の文脈でリン酸化され、その核移行をもたらす²⁷。一般に、RNA結合タンパク質のリン酸化は、その細胞内局在化、タンパク質間相互作用、RNA結合、および/または配列特異性に影響を及ぼすことが示されている²⁸。さらに、アクトミオシンのリン酸化は、頭蓋顔面発生²⁹、³⁰全体にわたる細胞骨格再配列をもたらし得、小さなインテグリン結合リガンドN結合型糖タンパク質などの細胞外マトリックスタンパク質のリン酸化は^、骨格発生中のバイオミネラリゼーションに寄与する³¹。上記および他の多くの例を通して、頭蓋顔面発達中のタンパク質リン酸化に幅広い意味合いがあることは明らかである。さらなるレベルの調節を加えると、タンパク質リン酸化はホスファターゼによってさらに調節され、ホスファターゼはリン酸基を除去することによってキナーゼを打ち消す。

受容体レベルとエフェクター分子レベルの両方でのこれらのリン酸化事象は、シグナル伝達経路の伝播にとって重要であり、最終的には核内の遺伝子発現の変化をもたらし、遊走、増殖、生存、分化などの特定の細胞活性を駆動し、哺乳動物の顔の適切な形成をもたらす。キナーゼおよびホスファターゼとのタンパク質相互作用の状況特異性、PTMの結果生じる変化、および細胞活性に対するそれらの影響を考慮すると、これらのパラメータを生理学的に関連する設定で研究することが重要であり、頭蓋顔面発達に対するリン酸化事象の寄与を完全に理解する。ここでは、タンパク質のリン酸化、したがって哺乳類の頭蓋顔面発達中のシグナル伝達経路の活性化を研究するための2つの文脈の例が提供される:マウスの顔面プロセス、特にE11.5上顎プロセス、およびE13.5二次口蓋棚に由来する培養マウス胚性口蓋間葉細胞 – 一次³²および不死化³³の両方.E11.5では、上顎突起は側鼻突起および内側鼻突起¹と融合する過程にあり、それによってマウス頭蓋顔面発達中の臨界時点を表す。さらに、口蓋棚に由来する上顎プロセスおよび細胞がここで選択されたのは、後者の構造が前者の誘導体であり、それによって研究者に、関連する文脈においてインビボおよびインビトロでタンパク質リン酸化を調査する機会を提供するからである。しかし、このプロトコルは、代替の顔のプロセスや発達の時点にも適用できます。

リン酸化タンパク質を研究する上で重要な問題は、豊富な環境ホスファターゼによってタンパク質単離中に容易に脱リン酸化されることである。この障壁を克服するために、リン酸化タンパク質の単離を可能にする標準的な実験室法への適応および改変が議論される。さらに、リン酸化タンパク質の適切な分析と定量のためのベストプラクティスが提供されています。これらの技術は、特に薬理学的阻害剤および/またはマウス遺伝子モデルと組み合わせて、頭蓋顔面発達中に活動する様々なシグナル伝達経路のダイナミクスおよび役割についてのより大きな洞察を得るために使用することができる。