Summary

Deniz Anemonlardan Elde Edilen Ham Ekstraktlarda Hemolitik ve Fosfolipaz Aktivitesinin Basit Biyotahlillerle Tanımlanması

Published: March 29, 2022
doi:

Summary

Burada, deniz anemonundan ham zehir ekstraktı elde etmek ve hemolitik ve fosfolipaz aktivitesini tespit etmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Abstract

Deniz anemon zehiri bileşimi polipeptit ve protein olmayan molekülleri içerir. Sitolitik bileşenler, yeni moleküler araçların tasarlanması için yüksek biyoteknolojik ve biyomedikal potansiyele sahiptir. Deniz anemon zehiri, ektodermden glandüler hücrelerde ve her ikisi de deniz anemon gövdesi boyunca dağılmış olan nematokistler adı verilen alt hücresel yapılarda bulunur. Bu özellik zorluklar anlamına gelir, çünkü zehir bileşenlerini diğer toksik olmayan moleküllerle serbest bırakmak için hücreler ve nematosist lize edilmelidir. Bu nedenle, ilk olarak, zehir ham bir ekstrakttan (farklı ve çeşitli moleküllerin ve doku kalıntılarının karışımı) türetilir. Bir sonraki adım, spesifik biyoaktivitelere sahip polipeptitleri tespit etmektir. Burada, sitolisinlerin varlığını tanımlamak için deniz anemonunun ham ekstraktını ve biyotahlilini elde etmek için etkili bir strateji açıklıyoruz. İlk adım, sitolisinleri serbest bırakmak için ucuz ve basit teknikleri (karıştırılmış ve dondurarak çözülme döngüsü) içerir. En yüksek sitolitik aktiviteyi ve proteini elde ettik (20 g kuru ağırlıktan ~ 500 mg protein). Daha sonra, ekstraktın polipeptit karmaşıklığı, 10 kDa ile 250 kDa arasında moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit eden SDS-PAGE jeli ile analiz edildi. Hemolitik tahlilde koyun kırmızı kan hücreleri kullandık ve HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL) belirledik. Buna karşılık, ham ekstraktta fosfolipazların varlığı, agarozlu katı bir ortamda substrat olarak yumurta sarısı kullanılarak belirlendi. Genel olarak, bu çalışma ham ekstraktı hazırlamak için verimli ve ucuz bir protokol kullanır ve sitolisinleri, biyoteknolojik ve biyomedikal çıkarları olan molekülleri tanımlamak için tekrarlanabilir biyotahliller uygular.

Introduction

Deniz hayvanları, biyolojik olarak aktif bileşiklerin zengin bir kaynağıdır. Son yıllarda, deniz anemon zehirinin bileşimi, hemolitik , sitotoksik, enzimatik (fosfolipaz, proteaz, kitinaz) ve nörotoksik aktiviteye sahip polipeptitlerin çeşitliliğini ve proteolitik aktivite üzerindeki inhibitör etkileri içerdiğinden bilimsel dikkat çekmiştir1. Ek olarak, bu polipeptitler biyoteknolojik ve terapötik kullanımda moleküler araçların geliştirilmesi için potansiyel kaynaklardır 2,3.

Deniz anemon zehiri ve moleküler bileşenleri hakkında, zehirin elde edilmesinin, hatta izolasyonun ve toksinlerin karakterizasyonunun karmaşıklığı nedeniyle çok az rapor vardır. Raporlarda kullanılan ekstraksiyon yöntemleri, zehir üretimi ile ilişkili ve ilgisi olmayan hücrelerin içeriğinin lizis ve boşaltılmasını içeriyordu1.

Tüm cnidarian’larda özel bir özellik, tek bir anatomik bölgede merkezileştirilmiş zehirin üretimi ve serbest bırakılması için bir sistemin olmamasıdır. Bunun yerine, nematosistler zehiritutan yapılardır 4,5. Epidermal bez hücreleri olarak adlandırılan diğer hücre tipleri de toksinler salgılar ve ayrıca deniz anemonlarının vücuduna dağılır6.

Zehirin elde edilmesindeki ilk ve en önemli zorluk, kararsız proteinlerin inaktivasyonu veya bozulması olmadan, sonraki işlemlerde yeterli manipülasyona sahip bir ekstraktın üretilmesidir. Daha sonra, hücreler lize edilmeli ve bileşenler – bu durumda, polipeptitler verimli ve hızlı bir şekilde ekstrakte edilmeli, proteoliz ve hidrolizden kaçınırken, diğer hücresel bileşenleri ortadan kaldırmalıdır7.

Bir deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için farklı yöntemler kullanılır; bazıları organizmayı feda etmeyi içerirken, diğerleri canlı tutulmasına izin verir. Organizmanın tüm vücudunun kullanımını ima eden yöntemler, zehirin sadece bazı bileşenlerini çıkaran organizmaları canlı tutan yöntemlere kıyasla, zehir8’den çoğu toksinin salınmasına izin verir9. Bir ekstraktın hazırlanması, ilgilenilen bir maddenin varlığının ve gücünün, farmakolojik etkileri in vivo veya in vitro yöntemlerle gözlemleme stratejilerini içeren belirli bir biyotahlil yoluyla değerlendirilmesini gerektirir10.

Deniz anemon zehiri sitolitik polipeptitler, gözenek oluşturan toksinler (PFT’ler)11 ve fosfolipazlar12 içerir; Bu moleküller, protein-lipid etkileşimi, kanser terapisindeki moleküler araçlar ve nanopore3’e dayanan biyosensörlerin incelenmesinde modellerdir. Deniz anemonlu PFT’lerin sınıflandırılması, boyutlarına veya moleküler ağırlıklarına göre, 5 kDa’dan 80 kDa’ya kadar gerçekleştirilir. En çok çalışılan ve aktinoporinler11 olarak bilinen 20 kDa PFT, antikanser, antimikrobiyal ve nanopor bazlı biyosensörler gibi olası uygulamalar için moleküler araçların geliştirilmesindeki biyomedikal potansiyeli nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Fosfolipazlar, özellikle fosfolipaz A2 (PLA2)13 dahil olmak üzere başka bir sitolisin, bir yağ asidi nedeniyle serbest bırakır ve fosfolipitleri hidrolize ederek hücre zarını dengesizleştirir. Bu etki mekanizması nedeniyle, PLA2, enflamatuar hastalıklardaki çalışma ve uygulamalar için önemli bir model olmayı vaat etmektedir. Hücre zarındaki lipit davranışı çalışmaları için bir model olarak hizmet edebilir14.

Burada, deniz anemonundan ham ekstrakt elde etmek için etkili bir protokol açıklıyoruz Anthopleura dowii Verrill, 1869 ve hemolizinleri ve fosfolipazları tespit etmek. Her ikisi de yeni moleküler araçlar tasarlamak için bir şablon olarak kullanılabilecek ilgili toksinlerdir.

Protocol

Deniz anemonları, Meksika Federal Hükümeti Ulusal Su Ürünleri Yetiştiriciliği, Balıkçılık ve Gıda Komisyonu yönergelerine göre toplanmıştır (izin numarası PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi, deniz anemonlarıyla yapılan tüm deneyleri onayladı. Koyun kanı örneği, Hayvansal Üretim ve Sağlık Pratik Öğretim ve Araştırma Merkezi’nden (CEPIPSA, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi) satın alındı. <p class="jove_tit…

Representative Results

Deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için kullanılan protokolün temsili sonuçları, iki tekniğin (ajitasyon ve donma ve çözülme döngüleri) birleştirilmesinin nematosistlerin etkili bir şekilde boşaltılmasını sağladığını ve toplam protein miktarının 500 mg (8 mg / mL) olduğunu göstermiştir (Şekil 3). Ham ekstraktın protein karmaşıklığı, SDS-PAGE elektroforezi yoluyla 10 kDa’dan ve 250 kDa’dan daha büyük olarak gözlemlene…

Discussion

Bilim ve endüstrinin farklı alanlarındaki uygulamalara sahip yeni bileşiklere olan yüksek talep, zehir çalışmalarına yol açmıştır. Venom, yeni moleküler araçlar üretmek için bir şablon görevi gören zengin bir molekül kaynağını temsil eder. Bununla birlikte, bu zehirlerin karmaşıklığı, bunları elde etmek ve incelemek için çeşitli yöntemlerin uygulanmasını ve birleştirilmesini gerektirir.

Burada, liyofilize örneklerle başlayan diğer deniz anemon türlerini…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) tarafından IT200819 hibe numarası ile desteklenmiştir. Yazarlar, Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC’ye bu makalenin İngilizce dilbilgisini kontrol ettiği için teşekkür eder; ve Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) ve Juan Manuel Barbosa Castillo’nun (Instituto de Fisiología Celular, UNAM) teknik yardımı. Ayrıca koyun kanı elde ettiği için Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro’ya (CEPIPSA) teşekkür ederiz. Özellikle ICAT-UNAM Dr. José Saniger Blesa’ya video kaydı için laboratuvarındaki tesisler için teşekkür ederiz.

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

Referências

  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
  3. Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
  4. Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
  5. Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).
  6. Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
  7. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
  8. Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
  9. Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
  10. Hader, D., Erzinger, G. . Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).
  11. Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
  12. Nevalainen, T. J., et al. Phospholipase A2 in cnidaria. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).
  13. Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis – its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
  14. Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  17. Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
  18. Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
  19. Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
  20. de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
  21. Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
  22. Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
  23. Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
  24. Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
  25. Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
  26. Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).

Play Video

Citar este artigo
Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

View Video