Summary

簡単なバイオアッセイによる海アネモンからの粗抽出物中の溶血性およびホスホリパーゼ活性の同定

Published: March 29, 2022
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Summary

ここでは、イソギンチャクから粗毒抽出物を取得し、その溶血作用およびホスホリパーゼ活性を検出するためのプロトコールについて記載する。

Abstract

イソギンチャク毒組成物は、ポリペプチド分子および非タンパク質分子を含む。細胞溶解成分は、新しい分子ツールを設計するための高いバイオテクノロジーおよび生物医学的可能性を秘めています。イソギンチャク毒は、線虫嚢胞と呼ばれる外胚葉および細胞下構造からの腺細胞に位置し、どちらもイソギンチャク体全体に分布している。この特性は、細胞および線虫嚢胞を溶解して他の非毒性分子と共に毒成分を放出しなければならないため、課題を意味する。したがって、まず、毒は粗抽出物(異なる多様な分子および組織破片の混合物)に由来する。次のステップは、特異的な生理活性を有するポリペプチドを検出することである。ここで、イソギンチャク粗抽出物を得るための効率的な戦略と、サイトライシンの存在を同定するためのバイオアッセイについて説明する。最初のステップは、細胞ライシンを放出するための安価で簡単な技術(攪拌および凍結融解サイクル)を含む。我々は、最も高い細胞溶解活性およびタンパク質(乾燥重量の20gから〜500mgのタンパク質)を得た。次に、抽出物のポリペプチド複雑性をSDS−PAGEゲルによって分析し、10kDa〜250kDaの間の分子量を有するタンパク質を検出した。溶血アッセイでは、ヒツジ赤血球を使用し、HU50 (11.1 ± 0.3 μg/mL)を測定した。対照的に、粗抽出物中のホスホリパーゼの存在は、アガロースを有する固体培地中の基質として卵黄を用いて決定した。全体として、この研究は、粗抽出物を調製するために効率的で安価なプロトコルを使用し、複製可能なバイオアッセイを適用して、生物工学的および生物医学的関心を有する細胞分解分子を同定する。

Introduction

海洋動物は生物学的に活性な化合物の豊富な供給源です。ここ数十年で、イソギンチャク毒の組成は、溶血性、細胞毒性、酵素的(ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、キチナーゼ)、および神経毒性活性およびタンパク質分解活性に対する阻害効果を有する多様なポリペプチドを含むため、科学的注目を集めている1。加えて、これらのポリペプチドは、バイオテクノロジーおよび治療的使用における分子ツールの開発のための潜在的な供給源である2,3

イソギンチャク毒とその分子成分に関する報告は、毒物の入手の複雑さ、さらには毒素の単離、および特性評価のためにほとんどない。報告書で使用された抽出方法は、毒産生1に関連および無関係である細胞の内容物を溶解および空にすることを含んでい

すべての狂信者の特定の特徴は、単一の解剖学的領域に集中した毒の生産と放出のためのシステムがないことである。代わりに、線虫嚢胞は毒4,5を保持する構造である。表皮腺細胞と呼ばれる他の種類の細胞も毒素を分泌し、イソギンチャク6の体全体に分布している。

毒物を得る上で最初で最も重要な課題は、不安定なタンパク質の不活性化または分解なしに、後続のプロセスで十分な操作を伴う抽出物の生成である。次に、細胞を溶解しなければならず、そして成分−この場合、ポリペプチドを効率的かつ迅速に抽出しなければならず、タンパク質分解および加水分解を回避しながら、他の細胞成分7を除去しなければならない。

イソギンチャクの粗抽出物を得るために異なる方法が使用される。生物を犠牲にすることを含むものもあれば、生き続けることを許すものもあります。生物の全身の使用を暗示する方法は、毒9の一部の成分のみを抽出する生物を生き続ける方法と比較して、毒8からほとんどの毒素の放出を可能にする。抽出物の調製には、インビボまたはインビトロ法によって薬理学的効果を観察する戦略を含む特定のバイオアッセイを通して目的の物質の存在および効力を評価することが必要である10

イソギンチャク毒は、細胞溶解性ポリペプチド、孔形成毒素(PFT)11、およびホスホリパーゼ12を含有する。これらの分子は、タンパク質-脂質相互作用の研究におけるモデルであり、がん治療における分子ツールであり、ナノポア3に基づくバイオセンサーである。イソギンチャクPFTの分類は、5kDaから80kDaまでのそれらのサイズまたは分子量に従って行われる。アクチノポリン11として最も研究され、知られている20kDaのPFTは、抗癌、抗菌、およびナノポアベースのバイオセンサーとして可能な用途のための分子ツールの開発におけるその生物医学的可能性のために特に興味深い。ホスホリパーゼ、具体的にはホスホリパーゼA2(PLA2)13を含む別のサイトライシンは、リン脂質を加水分解して脂肪酸を放出し、細胞膜を不安定にする。この作用機序のために、PLA2は炎症性疾患における研究および応用のための必須モデルとなることが約束される。細胞膜14における脂質挙動の研究のためのモデルとして役立つ可能性がある。

ここでは、イソギンチャク Anthopleura dowii Verrill, 1869から粗抽出物を得て、ヘモリシンおよびホスホリパーゼを検出するための効率的なプロトコールについて述べる。どちらも関連する毒素であり、新しい分子ツールを設計するためのテンプレートとして使用できます。

Protocol

イソギンチャクは、メキシコ連邦政府の水産養殖、漁業、および食品のための国家委員会のガイドラインに従って収集されました(許可番号PPF / DGOPTA 07332.250810.4060)。メキシコ国立自治大学バイオテクノロジー研究所の生命倫理委員会は、イソギンチャクによるすべての実験を承認しました。羊の血液サンプルは、動物生産と健康の実践的な教育と研究のためのセンター(CEPIPSA、メキシコ国立自…

Representative Results

イソギンチャクの粗抽出物を得るために使用されたプロトコールの代表的な結果は、2つの技術(攪拌および凍結融解のサイクル)を組み合わせることで、線虫嚢胞の効率的な排出が得られ、タンパク質の総量は500mg(8mg / mL)であったことを示した(図3)。 粗抽出物のタンパク質の複雑さは、SDS-PAGE電気泳動により、10 kDaから250 kDaを超えるものを観察する?…

Discussion

科学と産業のさまざまな分野での応用を持つ新しい化合物に対する高い需要は、毒の研究につながっています。Venomは、新しい分子ツールを生成するためのテンプレートとして機能する分子の豊富なソースを表します。しかし、これらの毒の複雑さは、それらを取得し、研究するための様々な方法の実装と組み合わせを必要とします。

ここでは、凍結乾燥標本から始めて…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) の支援を受け、助成金番号はIT200819でした。著者らは、この原稿の英語の文法をチェックしたTom Musselman, Rock Paper Editing, LLCに認めている。サマンタ・ヒメネス(CICESE、エンセナダ)とフアン・マヌエル・バルボサ・カスティージョ(UNAMフィシオロギア・セルラー研究所)の技術支援。また、羊の血を手に入れてくれたアウグスト・セザール・リザラゾ・チャパロ博士(CEPIPSA)にも感謝します。ICAT-UNAMのホセ・サニガー・ブレサ博士の研究室のビデオ録画施設に特に感謝します。

Materials

15 mL conical centrifuge tube Corning 430766
2-Bromophenol blue Sigma B75808
2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430828
Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9515-03
Acrylamide Promega V3115
Agarose Promega V3125
Bisacrylamide Promega V3143
Bovine Serum Albumin Fraction V Sigma A3059-100G
Bradford Protein Assays Bio-Rad 5000006
Calcium chloride Sigma-Aldrich C3306
Cell culture plates 96 well, V-bottom Corning 3894
Centrifuge Eppendorf 5804R
Centrifuge tubes Corning CLS430829
ChemiDoc MP system Bio-Rad 1708280
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Clear flat.bottom 96-Well Plates Thermo Scientific 3855
Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad #1610406
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610400
Dextrose J.T. Baker 1916-01
Ductless Enclosure Labconco Vertical https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ Bio Rad. Gel Documentation System
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-4L
Hemocytometer Marienfeld 650030
ImageJ (Software) NIH, USA Version 1.53c
Incubator 211 Labnet I5211 DS
Methanol J.T. Baker 9049-03
Mini-PROTEAN tetra cell Bio-Rad 1658000EDU
Na2HPO4 J.T. Baker 3824-01
NaCl J.T. Baker 3624-01
NaH2PO4.H2O J.T. Baker 3818-05
Origin software version 9 To design the plot with sigmoidal adjustments
Petridish Falcon 351007
Pipetman kit Gilson F167380
Precast mini gel BioRad 1658004
Prestained Protein Ladder Thermo Scientific 26620
Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 252433
SDS Sigma-Aldrich L4509
Sodium citrate dihydrate JT Baker 3646-01
Spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC G10S UV-VIS
Tris Base Sigma-Aldrich 77-86-1
Volt Power Supply Hoefer PS300B

Referências

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Ramírez-Carreto, S., Salazar-García, S. I., Macías Martínez, G., Rodríguez-Almazán, C. Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays. J. Vis. Exp. (181), e63630, doi:10.3791/63630 (2022).

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