Kvantifiering av reaktiva syrearter med användning av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetatsond och flödescytometri i Müller glialceller

Den neurala näthinnan är en mycket organiserad vävnad som presenterar väldefinierade neuronala lager. I dessa är neuroner (ganglion, amakrin, bipolär, horisontell och fotoreceptorceller) sammankopplade med varandra och även med Müller-glialceller (MGC) och astrocyter, vilket leder till adekvat fototransduktion och bearbetning av visuell information ^1,2. MGC är kända för att ha en viktig roll i underhållet av retinal homeostas eftersom de passerar hela retinalsektionen och därmed kan de interagera med alla celltyper som modulerar flera skyddsprocesser. Det har rapporterats att MGC har flera viktiga funktioner för underhåll och överlevnad av retinala neuroner, inklusive glykolys för att ge energi till neuroner, avlägsnande av neuronalt avfall, återvinning av neurotransmittorer och frisättning av neurotrofa faktorer, bland annat ^3,4,5.

Å andra sidan är inflammation, oxidativ och nitrosativ stress involverad i patogenesen och utvecklingen av många mänskliga sjukdomar, inklusive retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalansen i celler beror på tät reglering av ROS-nivåer. ROS genereras ständigt under fysiologiska förhållanden som ett resultat av aerob andning huvudsakligen. De viktigaste medlemmarna i ^ROS-familjen inkluderar reaktiva fria radikaler såsom superoxidanjonen (_{O2͘͘͘͘•}−), hydroxylradikaler (^•OH), olika peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) och den icke-radikala väteperoxiden (_H2O2)^12,13. Under de senaste åren har det blivit uppenbart att ROS spelar en viktig signalroll i cellerna genom att styra väsentliga processer. MGC har ett starkt antioxidantförsvar genom aktivering av den transkriptionella kärnfaktorn erytroid-2-relaterad faktor 2 (Nrf2) och det efterföljande uttrycket av antioxidantproteiner för att eliminera överdriven produktion av ROS under patologiska förhållanden 14,15,16. När cellerna förlorar sin redoxbalans på grund av en överdriven produktion av ROS eller en defekt förmåga att ta bort ROS, främjar ackumuleringen av oxidativ stress skadliga modifieringar i proteiner, lipider och DNA, vilket leder till cellulär stress eller död. Ökningen av det retinala antioxidantförsvarssystemet förbättrar upplösningen och förebyggandet av retinopatier, såsom ROP och RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Därför är mätningen av ROS-produktion i realtid ett kraftfullt och användbart verktyg.

Det finns flera metoder för att mäta ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Bland dessa är 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) sond en av de mest använda teknikerna för att direkt kvantifiera redoxtillståndet för en cell 25,26,27,28. Denna sond är lipofil och icke-fluorescerande. Diffusion av denna sond över cellmembranet möjliggör dess klyvning genom intracellulära esteraser vid de två esterbindningarna, vilket ger en relativt polär och cellmembranogenomtränglig produkt, 2′,7′-diklorfluorescein (_H2DCF). Denna icke-fluorescerande molekyl ackumuleras intracellulärt, och efterföljande oxidation av ROS ger den högfluorescerande produkten DCF. Oxidationen av sonden är produkten av verkan av flera typer av ROS (peroxinitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid eller peroxider), som kan detekteras genom flödescytometri eller konfokalmikroskopi (emission vid 530 nm och excitation vid 485 nm). Begränsningen av denna teknik är att superoxid och väteperoxid inte reagerar starkt med_H2DCF ^25,29. I den här artikeln använder vi DCFH-DA-sond för att mäta och kvantifiera ROS med flödescytometri. Av den anledningen inducerar vi ROS-produktion genom att stimulera MGC med ROS-inducerare, A eller B, innan vi laddar cellerna med den fluorescerande sonden. Dessutom använder vi en antioxidantförening. Slutligen visar vi representativa och tillförlitliga data som erhållits med hjälp av detta protokoll.