Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

La rétine neurale est un tissu très organisé qui présente des couches neuronales bien définies. Dans ceux-ci, les neurones (cellules ganglionnaires, amacrines, bipolaires, horizontales et photoréceptrices) sont interconnectés les uns aux autres ainsi qu’aux cellules gliales de Müller (MGC) et aux astrocytes, ce qui conduit à une phototransduction et à un traitement adéquats de l’information visuelle ^1,2. Les MGC sont connus pour avoir un rôle important dans le maintien de l’homéostasie rétinienne car ils traversent toute la section rétinienne et, par conséquent, ils peuvent interagir avec tous les types de cellules qui modulent de multiples processus de protection. Il a été rapporté que les MGC ont plusieurs fonctions importantes pour le maintien et la survie des neurones rétiniens, y compris la glycolyse pour fournir de l’énergie aux neurones, l’élimination des déchets neuronaux, le recyclage des neurotransmetteurs et la libération de facteurs neurotrophiques, entre autres ^3,4,5.

D’autre part, l’inflammation, le stress oxydatif et nitrosatif sont impliqués dans la pathogenèse et la progression de nombreuses maladies humaines, y compris les rétinopathies ^{6,7,8,9,10,11}. L’équilibre redox dans les cellules dépend d’une régulation stricte des niveaux de ROS. Les ROS sont constamment générés dans des conditions physiologiques à la suite de la respiration aérobie principalement. Les principaux membres de la famille ROS comprennent les radicaux libres réactifs tels que l’anion superoxyde (O_2͘͘͘͘^•−), les radicaux hydroxyles (^•OH), divers peroxydes (ROOR′), les hydroperoxydes (ROOH) et le peroxyde d’hydrogène sans radical (_H2O₂)^12,13. Au cours des dernières années, il est devenu évident que les ROS jouent un rôle de signalisation important dans les cellules en contrôlant les processus essentiels. Les MGC ont une forte défense antioxydante par l’activation du facteur nucléaire transcriptionnel érythroïde-2-lié au facteur 2 (Nrf2) et l’expression ultérieure de protéines antioxydantes pour éliminer la production excessive de ROS dans des conditions pathologiques 14,15,16. Lorsque les cellules perdent leur équilibre redox en raison d’une production exagérée de ROS ou d’une capacité défectueuse à éliminer les ROS, l’accumulation de stress oxydatif favorise des modifications nocives dans les protéines, les lipides et l’ADN, entraînant un stress cellulaire ou la mort. L’augmentation du système de défense antioxydant rétinien améliore la résolution et la prévention des rétinopathies, telles que ROP et RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Par conséquent, la mesure de la production de ROS en temps réel est un outil puissant et utile.

Il existe plusieurs méthodes pour mesurer la production de ROS ou le stress oxydatif dans les cellules. Parmi celles-ci, la sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) est l’une des techniques les plus largement utilisées pour quantifier directement l’état redox d’une cellule ^25,26,27,28. Cette sonde est lipophile et non fluorescente. La diffusion de cette sonde à travers la membrane cellulaire permet son clivage par des estérases intracellulaires au niveau des deux liaisons ester, produisant un produit relativement polaire et imperméable à la membrane cellulaire, la 2′,7′-dichlorofluorescéine (_H2DCF). Cette molécule non fluorescente s’accumule intracellulairement, et l’oxydation ultérieure par ROS donne le produit hautement fluorescent DCF. L’oxydation de la sonde est le produit de l’action de plusieurs types de ROS (peroxynitrite, radicaux hydroxyles, oxyde nitrique ou peroxydes), qui peuvent être détectés par cytométrie en flux ou microscopie confocale (émission à 530 nm et excitation à 485 nm). La limite de cette technique est que le superoxyde et le peroxyde d’hydrogène ne réagissent pas fortement avec_H2DCF ^25,29. Dans cet article, nous utilisons la sonde DCFH-DA pour mesurer et quantifier les ROS par cytométrie en flux. Pour cette raison, nous induisons la production de ROS en stimulant les MGC avec un inducteur ROS, A ou B, avant de charger les cellules avec la sonde fluorescente. De plus, nous utilisons un composé antioxydant. Enfin, nous montrons des données représentatives et fiables obtenues à l’aide de ce protocole.