प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का परिमाणीकरण 2', 7′-Dichlorofluorescein Diacetate Probe और Müller Glial कोशिकाओं में फ्लो-साइटोमेट्री का उपयोग करके
Summary
यहां, हम सेलुलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का पता लगाने के लिए एक व्यवस्थित, सुलभ और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जो मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) में 2′, 7′-डाइक्लोरोफ्लोरोरेसीन डायसीटेट प्रोब (डीसीएफएच-डीए) का उपयोग करते हैं। यह विधि एक प्रवाह साइटोमीटर के साथ कुल सेलुलर आरओएस स्तरों को निर्धारित करती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए बहुत आसान है, उपयुक्त है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य.
Abstract
सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में रेडॉक्स संतुलन की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की बढ़ी हुई पीढ़ी प्रोटीन, लिपिड और डीएनए के संशोधन को बढ़ावा देती है, जो अंततः सेलुलर फ़ंक्शन और सेल मृत्यु में परिवर्तन का कारण बन सकती है। इसलिए, हानिकारक अपमान के जवाब में कोशिकाओं के लिए अपने एंटीऑक्सिडेंट रक्षा को बढ़ाने के लिए फायदेमंद है, या तो Keap1 / Nrf2 जैसे एंटीऑक्सिडेंट मार्ग को सक्रिय करके या रेडॉक्स स्कैवेंजर्स (विटामिन ए, सी, और ई, β-कैरोटीन, और पॉलीफेनोल्स, दूसरों के बीच) में सुधार करके। सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव रोगजनन और रेटिनोपैथी की प्रगति में शामिल हैं, जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) और रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी)। चूंकि मुलर ग्लियाल कोशिकाएं (एमजीसी) तंत्रिका रेटिना ऊतक के होमोस्टैसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, इसलिए उन्हें इन सेलुलर सुरक्षात्मक तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल माना जाता है। इस अर्थ में, एक पुनरुत्पादक और सरल विधि के साथ आरओएस स्तरों को परिमाणित करना एंटीऑक्सिडेंट सेल रक्षा तंत्र में भाग लेने वाले मार्गों या अणुओं के योगदान का आकलन करने के लिए आवश्यक है। इस लेख में, हम MGCs में DCFH-DA जांच और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ ROS के माप के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का पूरा विवरण प्रदान करते हैं। सॉफ़्टवेयर के साथ प्रवाह साइटोमेट्री डेटा प्रोसेसिंग के लिए महत्वपूर्ण चरण यहां प्रदान किए गए हैं, इसलिए पाठक ROS स्तरों (FITC के ज्यामितीय साधन) को मापने और प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम का विश्लेषण करने में सक्षम होंगे। ये उपकरण न केवल एक सेलुलर अपमान के बाद आरओएस में वृद्धि का मूल्यांकन करने के लिए अत्यधिक सहायक हैं, बल्कि कुछ अणुओं के एंटीऑक्सिडेंट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए भी हैं जो कोशिकाओं पर सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
तंत्रिका रेटिना एक बहुत ही संगठित ऊतक है जो अच्छी तरह से परिभाषित न्यूरोनल परतों को प्रस्तुत करता है। इनमें, न्यूरॉन्स (गैंग्लियन, एमेक्राइन, द्विध्रुवी, क्षैतिज और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं) एक-दूसरे से जुड़े हुए हैं और मुलर ग्लियाल कोशिकाओं (एमजीसी) और एस्ट्रोसाइट्स के साथ भी, जिससे पर्याप्त फोटोट्रांसडक्शन और दृश्य जानकारी 1,2 का प्रसंस्करण होता है। एमजीसी को रेटिना होमोस्टैसिस के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है क्योंकि वे पूरे रेटिना अनुभाग को पार करते हैं और इस प्रकार, वे सभी सेल प्रकारों के साथ बातचीत कर सकते हैं जो कई सुरक्षात्मक प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं। यह बताया गया है कि एमजीसी में रेटिना न्यूरॉन्स के रखरखाव और अस्तित्व के लिए कई महत्वपूर्ण कार्य हैं, जिनमें न्यूरॉन्स को ऊर्जा प्रदान करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस, न्यूरोनल कचरे को हटाना, न्यूरोट्रांसमीटर का पुनर्चक्रण, और न्यूरोट्रॉफिक कारकों की रिहाई शामिल है, दूसरों के बीच 3,4,5।
दूसरी ओर, सूजन, ऑक्सीडेटिव और नाइट्रोसेटिव तनाव कई मानव बीमारियों के रोगजनन और प्रगति में शामिल हैं, जिसमें रेटिनोपैथी 6,7,8,9,10,11 शामिल हैं। कोशिकाओं में रेडॉक्स संतुलन आरओएस स्तरों के तंग विनियमन पर निर्भर करता है। आरओएस मुख्य रूप से एरोबिक श्वसन के परिणामस्वरूप शारीरिक परिस्थितियों में लगातार उत्पन्न होते हैं। ROS परिवार के प्रमुख सदस्यों में प्रतिक्रियाशील मुक्त कण जैसे सुपरऑक्साइड अनियन (O2π•−), हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स (•OH), विभिन्न पेरोक्साइड (ROOR’), हाइड्रोपेरोक्साइड (ROOH), और कोई कट्टरपंथी हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2)12,13 शामिल हैं। पिछले वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि आरओएस आवश्यक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करके कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग भूमिका निभाता है। MGCs transcriptional परमाणु कारक के सक्रियण द्वारा एक मजबूत एंटीऑक्सिडेंट रक्षा है- 2 से संबंधित कारक 2 (Nrf2) और एंटीऑक्सीडेंट प्रोटीन के बाद की अभिव्यक्ति रोग की स्थिति 14,15,16 के तहत आरओएस के अत्यधिक उत्पादन को खत्म करने के लिए। जब कोशिकाएं आरओएस के अतिरंजित उत्पादन या आरओएस को हटाने की दोषपूर्ण क्षमता के कारण अपने रेडॉक्स संतुलन को खो देती हैं, तो ऑक्सीडेटिव तनाव का संचय प्रोटीन, लिपिड और डीएनए में हानिकारक संशोधनों को बढ़ावा देता है, जिससे सेलुलर तनाव या मृत्यु हो जाती है। रेटिना एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणाली की वृद्धि रेटिनोपैथी के संकल्प और रोकथाम में सुधार करती है, जैसे कि आरओपी और आरडी 17,18,19,20,21,22,23,24। इसलिए, वास्तविक समय में आरओएस उत्पादन का माप एक शक्तिशाली और उपयोगी उपकरण है।
कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन या ऑक्सीडेटिव तनाव को मापने के लिए कई तरीके हैं। इनमें से, 2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) जांच सीधे सेल 25,26,27,28 के रेडॉक्स राज्य को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक है। यह जांच लिपोफिलिक और गैर-फ्लोरोसेंट है। सेल झिल्ली के पार इस जांच का प्रसार दो एस्टर बांडों पर इंट्रासेल्युलर एस्टेरेस द्वारा अपनी दरार की अनुमति देता है, जो अपेक्षाकृत ध्रुवीय और सेल झिल्ली-अपारगम्य उत्पाद, 2′, 7′-डाइक्लोरोफ्लोरोरेससीन (एच2डीसीएफ) का उत्पादन करता है। यह गैर-फ्लोरोसेंट अणु इंट्रासेल्युलर रूप से जमा होता है, और आरओएस द्वारा बाद में ऑक्सीकरण अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद डीसीएफ उत्पन्न करता है। जांच का ऑक्सीकरण कई प्रकार के आरओएस (पेरोक्सिनिट्रिटाइट, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स, नाइट्रिक ऑक्साइड, या पेरोक्साइड) की कार्रवाई का उत्पाद है, जिसे फ्लो साइटोमेट्री या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (530 एनएम पर उत्सर्जन और 485 एनएम पर उत्तेजना) द्वारा पता लगाया जा सकता है। इस तकनीक की सीमा यह है कि सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच 2 डीसीएफ25,29 के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया नहीं करते हैं। इस लेख में, हम प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आरओएस को मापने और मापने के लिए डीसीएफएच-डीए जांच का उपयोग करते हैं। उस कारण से, हम ROS प्रेरक, ए या बी के साथ MGCs को उत्तेजित करके ROS उत्पादन को प्रेरित करते हैं, जो फ्लोरोसेंट जांच के साथ कोशिकाओं को लोड करने के लिए पिछले है। इसके अलावा, हम एक एंटीऑक्सिडेंट यौगिक का उपयोग करते हैं। अंत में, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि और विश्वसनीय डेटा दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई रोग संबंधी स्थितियां, जैसे कि कैंसर, भड़काऊ रोग, इस्केमिया / reperfusion, इस्केमिक हृदय रोग, मधुमेह, और रेटिनोपैथी, और उम्र बढ़ने जैसी शारीरिक स्थितियां, आरओएस overproduction 6,7,8,9,10,11 का कार…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को मारिया Pilar Crespo और पाउला Alejandra IBBICI के Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, अर्जेंटीना) प्रवाह cytometry और गैब्रिएला Furlan और Noelia Maldonado सेल संस्कृति सहायता के लिए सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वीडियो उत्पादन और संपादन के लिए विक्टर डियाज़ (एफसीक्यू के संस्थागत संचार के प्रो-सेक्रेटरी) को भी धन्यवाद देते हैं।
इस लेख को Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), और Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (सभी के लिए M.C.S.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
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