Количественная оценка активных форм кислорода с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетатного зонда и проточной цитометрии в глиальных клетках Мюллера

Нервная сетчатка представляет собой очень организованную ткань, которая представляет собой четко определенные нейронные слои. В них нейроны (ганглиозные, амакриновые, биполярные, горизонтальные и фоторецепторные клетки) взаимосвязаны друг с другом, а также с глиальными клетками Мюллера (MGC) и астроцитами, что приводит к адекватной фототрансдукции и обработке визуальной информации ^1,2. Известно, что MMC играют важную роль в поддержании гомеостаза сетчатки, потому что они пересекают весь отдел сетчатки и, таким образом, могут взаимодействовать со всеми типами клеток, которые модулируют несколько защитных процессов. Сообщалось, что MMC имеют несколько важных функций для поддержания и выживания нейронов сетчатки, включая гликолиз для обеспечения энергией нейронов, удаление нейронных отходов, рециркуляцию нейротрансмиттеров и высвобождение нейротрофических факторов, среди прочих ^3,4,5.

С другой стороны, воспаление, окислительный и нитрозативный стресс участвуют в патогенезе и прогрессировании многих заболеваний человека, включая ретинопатии ^{6,7,8,9,10,11}. Окислительно-восстановительный баланс в клетках зависит от жесткой регуляции уровней АФК. АФК постоянно вырабатываются в физиологических условиях в результате в основном аэробного дыхания. Основные члены семейства АФК включают реакционноспособные свободные радикалы, такие как супероксидный анион (O_2͘͘͘͘^•-), гидроксильные радикалы (^•OH), различные пероксиды (ROOR’), гидропероксиды (ROOH) и безрадикальный перекись водорода (_H2O₂)^12,13. В последние годы стало очевидно, что АФК играет важную сигнальную роль в клетках, контролируя основные процессы. МГК обладают сильной антиоксидантной защитой за счет активации транскрипционного ядерного фактора эритроид-2, связанного с фактором 2 (Nrf2) и последующей экспрессии антиоксидантных белков для устранения избыточной продукции АФК при патологических состояниях 14,15,16. Когда клетки теряют свой окислительно-восстановительный баланс из-за преувеличенной выработки АФК или дефектной способности удалять АФК, накопление окислительного стресса способствует вредным модификациям в белках, липидах и ДНК, что приводит к клеточному стрессу или смерти. Увеличение системы антиоксидантной защиты сетчатки улучшает разрешение и профилактику ретинопатий, таких как РН и РД 17,18,19,20,21,22,23,24. Поэтому измерение производства АФК в режиме реального времени является мощным и полезным инструментом.

Существует несколько методов измерения продукции АФК или окислительного стресса в клетках. Среди них зонд 2′,7′-дихлорфлуоресцеина диацетата (DCFH-DA) является одним из наиболее широко используемых методов прямой количественной оценки окислительно-восстановительного состояния клетки 25,26,27,28. Этот зонд является липофильным и нефлуоресцентным. Диффузия этого зонда через клеточную мембрану позволяет его расщепляться внутриклеточными эстеразами на двух эфирных связях, производя относительно полярный и непроницаемый клеточной мембраной продукт, 2′,7′-дихлорфлуоресцеин (_H2DCF). Эта нефлуоресцентная молекула накапливается внутриклеточным путем, и последующее окисление АФК дает высокофлуоресцентный продукт DCF. Окисление зонда является продуктом действия нескольких типов АФК (пероксинитрит, гидроксильные радикалы, оксид азота или пероксиды), которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии или конфокальной микроскопии (эмиссия при 530 нм и возбуждение при 485 нм). Ограничение этого метода заключается в том, что супероксид и перекись водорода не сильно реагируют с H₂DCF^25,29. В этой статье мы используем зонд DCFH-DA для измерения и количественной оценки АФК с помощью проточной цитометрии. По этой причине мы индуцируем производство АФК, стимулируя MMC индуктором АФК, А или В, перед загрузкой ячеек флуоресцентным зондом. Кроме того, мы используем антиоксидантное соединение. Наконец, мы показываем репрезентативные и достоверные данные, полученные с помощью этого протокола.