Protocolo Baseado em Microdissecção a Laser para a Análise LC-MS/MS do Perfil Proteômico de Grânulos de Neuromelanina

Cada tecido consiste em uma mistura heterogênea de diferentes tipos de células, mas o isolamento específico de um tipo de célula muitas vezes é indispensável para uma caracterização mais precisa. A microdissecção a laser (LMD), acoplando um microscópio com uma aplicação a laser, é uma ferramenta poderosa para o isolamento específico de áreas de tecido, células individuais ou subestruturas celulares de um composto complexo. A aplicação de LMD em combinação com espectrometria de massas (LMD-MS) já foi implementada com sucesso para diversas questões de pesquisa, incluindo o isolamento de DNA¹, RNA² e proteínas ^3,4,5. Neste protocolo, um protocolo LMD-MS revisado e otimizado é descrito para a análise proteômica do tecido cerebral post-mortem humano e componentes subcelulares para decifrar novos patomecanismos da doença de Parkinson.

A neuromelanina é um pigmento preto, quase insolúvel, encontrado nos neurônios catecolaminérgicos produtores de dopamina da substância negra pars compacta⁶. Juntamente com proteínas e lipídios, acumula-se em grânulos organelas circundados por uma dupla membrana, denominada grânulos de neuromelanina (NMGs)^7,8,9. Os NMGs podem ser observados a partir dos três anos de idade em humanos, aumentando em quantidade e densidade durante o processo de envelhecimento^10,11. Até o momento, não há uma hipótese definitiva sobre a formação de neuromelanina, mas uma suposição é que a neuromelanina é formada através da oxidação da dopamina¹². Outras hipóteses são baseadas na produção enzimática de neuromelanina (por exemplo, tirosinase)¹³. Neuromelanina em si foi encontrado para ter uma alta afinidade de ligação a lipídios, toxinas, íons metálicos e pesticidas. Com base nesses achados, supõe-se que a formação de NMGs proteja a célula do acúmulo de substâncias tóxicas e oxidativas e de toxinas ambientais^14,15. Além dessa função neuroprotetora, há evidências de que a neuromelanina pode causar efeitos neurodegenerativos, por exemplo, pela saturação de ferro e pela subsequente catálise dos radicais livres^16,17. Além disso, a neuromelanina liberada durante processos neurodegenerativos pode ser decomposta por peróxido de hidrogênio, o que poderia acelerar a necrose por metais reativos e outros compostos tóxicos previamente ligados à neuromelanina e pode contribuir para a neuroinflamação e danos celulares¹⁸. No entanto, até agora, o papel exato dos NMGs em processos neurodegenerativos, como no curso da doença de Parkinson, não é claramente compreendido. Ainda assim, os NMGs parecem estar envolvidos na patogênese da doença de Parkinson e sua análise específica é de extrema importância para desvendar seu papel na neurodegeneração. Infelizmente, animais de laboratório comuns (por exemplo, camundongos e ratos) e linhagens celulares não possuem NMGs¹⁹. Portanto, os pesquisadores confiam especialmente no tecido cerebral post-mortem para sua análise. No passado, o isolamento de NMG por centrifugação por gradiente de densidade dependia da disponibilidade de grandes quantidades de tecido da substância negra ^20,21. Hoje, o LMD apresenta uma ferramenta versátil para isolar especificamente NMGs de amostras de cérebro humano para, em seguida, analisá-los por LC-MS / MS.

Neste protocolo, uma versão melhorada e automatizada de um protocolo anterior²² é apresentada para o isolamento de NMGs e tecido circundante (SN), permitindo uma geração de amostras mais rápida, maior número de proteínas identificadas e quantificadas e uma redução severa das quantidades teciduais necessárias.