Summary

Мониторинг митохондриального дыхания в цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека в режиме реального времени

Published: October 19, 2021
doi:

Summary

Метаболическая адаптация имеет основополагающее значение для Т-клеток, поскольку она диктует дифференцировку, персистенцию и цитотоксичность. Здесь представлен оптимизированный протокол мониторинга митохондриального дыхания в ex vivo цитокин-дифференцированных первичных Т-клетках человека.

Abstract

Во время активации метаболизм Т-клеток приспосабливается к изменениям, которые влияют на их судьбу. Увеличение митохондриального окислительного фосфорилирования необходимо для активации Т-клеток, а выживание Т-клеток памяти зависит от ремоделирования митохондрий. Следовательно, это влияет на долгосрочный клинический исход иммунотерапии рака. Изменения качества Т-клеток часто изучаются с помощью проточной цитометрии с использованием хорошо известных поверхностных маркеров, а не непосредственно их метаболического состояния. Это оптимизированный протокол для измерения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека в режиме реального времени с использованием анализатора внеклеточного потока и цитокинов IL-2 и IL-15, которые по-разному влияют на метаболизм Т-клеток. Показано, что метаболическое состояние Т-клеток можно четко различить путем измерения потребления кислорода при ингибировании ключевых комплексов в метаболическом пути и что точность этих измерений сильно зависит от оптимальной концентрации ингибитора и стратегии инъекции ингибитора. Этот стандартизированный протокол поможет внедрить митохондриальное дыхание в качестве стандарта для пригодности Т-клеток при мониторинге и изучении иммунотерапии рака.

Introduction

Правильное развитие и функционирование Т-клеток необходимы для способности иммунной системы распознавать и реагировать на антигены. Митохондриальное окислительное фосфорилирование (OxPhos) изменяется в зависимости от состояния Т-клетки. Наивные Т-клетки преимущественно используют OxPhos для производства АТФ, тогда как активированные Т-клетки подвергаются метаболическому переходу, когда гликолиз становится доминирующим1. После эффекторной фазы небольшое оставшееся подмножество Т-клеток памяти возвращается к метаболическому состоянию, в котором доминирует OxPhos2,3. Изменения OxPhos следуют за дифференцировкой Т-клеток до такой степени, что даже подмножества Т-клеток могут быть дифференцированы по их специфическим свойствам OxPhos1. И наоборот, OxPhos важен для функции Т-клеток, и было продемонстрировано, что ингибирование OxPhos блокирует пролиферацию и выработку цитокинов Т-клеток4. Таким образом, способность количественно оценивать свойства Т-клеток OxPhos точным и воспроизводимым образом является мощным инструментом для всех, кто работает с Т-клетками.

В этом протоколе свойства Т-клеток OxPhos измеряются с помощью внеклеточного анализатора потока. Основная функция этого анализатора заключается в непрерывном измерении содержания кислорода в питательных средах анализируемых клеток. Предполагается, что кислород, удаленный из среды роста, поглощается клетками. При обработке клеток различными ингибиторами или модификаторами OxPhos падение поглощения кислорода связано с ингибированной или модулированной функцией. Например, ингибирование АТФ-синтазы приведет к снижению клеточного поглощения кислорода, который в противном случае использовался бы для производства АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другое оборудование, включая электрод Кларка и инструмент Oroboros, предлагает аналогичную функциональность, и каждый инструмент имеет разные преимущества и недостатки. Широкий спектр типов клеток может быть использован для исследований в этих устройствах, но одним из особенно сложных типов клеток являются первичные Т-лимфоциты человека5. Из-за их небольшого размера, плохой выживаемости ex vivo и неадгезивных свойств первичные Т-клетки человека могут быть сложными для изучения.

Это протокол для изучения митохондриального дыхания первичных Т-клеток человека с помощью внеклеточного анализатора. Протокол разделен на оптимизационный прогон, где определяются оптимальные концентрации клеточного числа на лунку, а также оптимальная концентрация олигомицина и FCCP. Кроме того, проводится анализ, в котором используются оптимизированные условия.

Используя полученные из крови человеческие PBMCs и ex vivo первичные Т-клеточные культуры, этот протокол демонстрирует важность оптимальной концентрации ингибиторов и актуальность использования отдельных вместо последовательной инъекции митохондриальных ингибиторов при работе с чувствительными типами клеток. Наконец, показано, что этот анализ может надежно обнаруживать тонкие различия в митохондриальном дыхании при поляризации цитокинами IL-2 и IL-15.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами больницы Херлев и столичного региона Дании. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол содержит инструкции как для запуска оптимизации, так и для запуска анализа. Это четко написано в тексте, когда инструкции предназнач?…

Representative Results

Правильное определение свойств OxPhos является незаменимым инструментом при изучении Т-клеток. Однако, если условия анализа не были оптимизированы, существует значительный риск введения в заблуждение или ошибочных результатов. В этом протоколе основное внимание уделяется оптимизации к…

Discussion

Детальная и правильная количественная оценка окислительного фосфорилирования является незаменимым инструментом при описании энергетических состояний Т-клеток. Состояние митохондриальной приспособленности может быть напрямую связано с потенциалом активации Т-клеток, выживаемость…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Каспер Мёльгаард и Анне Рахбех получили гранты от Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Каспер Мёльгаард также получил грант от Børnecancerfonden.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

Referências

  1. vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  2. Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
  3. vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
  4. Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  5. vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
  6. Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  7. Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
  8. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  9. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  10. Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).

Play Video

Citar este artigo
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

View Video