Crecimiento, Purificación, Y La Titulación Del Virus Del Herpes Simple Oncolítico
Summary
En este manuscrito, describimos un método simple de crecimiento, de purificación, y de titulación del virus oncolítico del simplex de herpes para el uso preclínico.
Abstract
Los virus oncolíticos (OVs), tales como el virus oncolítico del simplex de herpes (oHSV), son una estrategia de tratamiento de rápido crecimiento en el campo de la inmunoterapia del cáncer. Los OVs, incluyendo oHSV, replican selectivamente adentro y matan a las células cancerosas (ahorrando las células sanas/normales) mientras que inducen inmunidad antitumores. Debido a estas propiedades únicas, las estrategias oHSV-basadas del tratamiento se están utilizando cada vez más para el tratamiento del cáncer, preclínico y clínico, incluyendo el laherparevec del talimogene aprobado por la FDA (T-Vec). El crecimiento, la purificación y la titulación son tres técnicas de laboratorio esenciales para cualquier OVs, incluyendo oHSVs, antes de que puedan ser utilizados para estudios experimentales. Este papel describe un método paso a paso simple para amplificar el oHSV en células de Vero. A medida que los oHSV se multiplican, producen un efecto citopático (CPE) en las células Vero. Una vez que el 90-100% de las células infectadas muestran un CPE, se cosechan suavemente, se tratan con benzonasa y cloruro de magnesio (MgCl2),se filtran y se someten a purificación utilizando el método de gradiente de sacarosa. Después de la purificación, el número de oHSV infeccioso (designado como unidades formadores de placa o PKU) se determina mediante un “ensayo de placa” en las células Vero. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para preparar la acción del oHSV del alto-título para los estudios ines vitro en cultivo celular y experimentos animales in vivo.
Introduction
Los virus oncolíticos (OVs) son una forma emergente y única de inmunoterapia contra el cáncer. Los OVs se replican selectivamente en y lisean las células tumorales (ahorrando células normales/sanas)1 mientras se induce la inmunidad antitumoral2. El virus del herpes simple oncolítico (oHSV) es uno de los virus más ampliamente estudiados entre todos los OVs. Está más lejos a lo largo de la clínica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) siendo el primer y único OV en recibir la aprobación de la FDA en los EE.UU. para el tratamiento del melanoma avanzado3. Además de T-VEC, muchos otros oHSVs genéticamente modificados se están probando preclínica y clínicamente en diferentes tipos de cáncer3,4,5,6,7,8. La actual biotecnología avanzada del ADN recombinante ha aumentado aún más la viabilidad de la ingeniería de nuevos oHSV que codifican para transgenes terapéuticos3,5. Un sistema eficiente de propagación, purificación y determinación de títulos de oHSV es crítico antes de que cualquier oHSV (recientemente desarrollado) pueda probarse para estudios in vitro e in vivo. Este papel describe un método simple paso a paso del crecimiento del oHSV (en células de Vero), de la purificación (por el método del sacarosa-gradiente), y de la titulación (por un análisis de la placa del oHSV en células de Vero) (cuadro 1). Se puede adoptar fácilmente en cualquier entorno de laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL2) para lograr un stock viral de alta calidad para estudios preclínicos.
Vero, una línea celular de riñón de mono verde africano, es la línea celular más comúnmente utilizada para la propagación del oHSV9,10,11,12,13 ya que las células vero tienen una vía de señalización de interferón antiviral defectuosa14. Otras líneas celulares con estimulador inactivado de genes de interferón (STING) también se pueden utilizar para el crecimiento de oHSV12,13. Este protocolo utiliza las células de Vero para el crecimiento del oHSV y el análisis de la placa. Después de la propagación, las células infectadas por oHSV se cosechan, se lisan y se someten a purificación, en donde las células lisadas primero se tratan con ncleasa benzonasa para degradar el ADN de la célula huésped, prevenir la agregación ácido nucleico-proteína y reducir la viscosidad del lisato celular. Como la activación adecuada de la benzonasa a menudo requiere Mg2 +,1-2 mM MgCl2 se utiliza en este protocolo15. Los restos de la célula huésped del lisato de células tratadas con benzonasa se eliminan aún más mediante filtración en serie antes de la centrifugación de gradiente de sacarosa de alta velocidad. Un cojín viscoso de solución de sacarosa al 25% ayuda a asegurar una tasa más lenta de migración del virus a través de la capa de sacarosa, dejando los componentes relacionados con la célula huésped en el sobrenadante, mejorando así la purificación y limitando la pérdida de virus en el pellet16. El oHSV purificado se titula en las células Vero, y las placas virales se visualizan mediante la tinción de Giemsa17 o X-gal (para la codificación LacZ oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo comienza con el crecimiento de oHSV en células Vero de paso bajo. La confluencia de la monocapa celular Vero debe ser de ~80% en el momento de la inoculación del virus, ya que las células cubiertas de vegetación pueden desarrollar estructuras fibrosas apretadas que pueden reducir la entrada de oHSV en las células Vero20. Una vez que se observa un 90-100% de CPE, se elimina el sobrenadante del cultivo, se cosechan las células, se resuspensan en VB/sobrenadante (véase el paso 1.4…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio Saha fue apoyada en parte por fondos del DOD (W81XWH-20-1-0702) y la Fundación Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin y Melissa R.M. Humphrey fueron parcialmente apoyados por los NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
Referências
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