Summary

Crescita, purificazione e titolazione del virus Oncolytic Herpes Simplex

Published: May 13, 2021
doi:

Summary

In questo manoscritto, descriviamo un semplice metodo di crescita, purificazione e titolazione del virus dell’herpes simplex oncolitico per uso preclinico.

Abstract

I virus oncolitici (OV), come il virus dell’herpes simplex oncolitico (oHSV), sono una strategia di trattamento in rapida crescita nel campo dell’immunoterapia oncologica. Gli OV, incluso l’oHSV, replicano selettivamente e uccidono le cellule tumorali (risparmiando cellule sane / normali) mentre inducono l’immunità antitumorale. A causa di queste proprietà uniche, le strategie di trattamento basate su oHSV sono sempre più utilizzate per il trattamento del cancro, preclinicamente e clinicamente, incluso il talimogene laherparevec (T-Vec) approvato dalla FDA. La crescita, la purificazione e la titolazione sono tre tecniche di laboratorio essenziali per qualsiasi VS, compresi gli OHSV, prima che possano essere utilizzati per studi sperimentali. In questo articolo viene descritto un semplice metodo passo-passo per amplificare l’oHSV nelle celle Vero. Man mano che gli oHSV si moltiplicano, producono un effetto citopatico (CPE) nelle cellule di Vero. Una volta che il 90-100% delle cellule infette mostra un CPE, vengono raccolte delicatamente, trattate con benzonasi e cloruro di magnesio (MgCl2),filtrate e sottoposte a purificazione utilizzando il metodo del gradiente di saccarosio. Dopo la purificazione, il numero di oHSV infettivi (designati come unità di formatura della placca o PFU) è determinato da un “saggio di placca” nelle cellule di Vero. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per preparare stock di oHSV ad alto titolo per studi in vitro sulla coltura cellulare e esperimenti su animali in vivo.

Introduction

I virus oncolitici (UV) sono una forma emergente e unica di immunoterapia oncologica. I televisori replicano selettivamente nelle cellule tumorali e lenalisi (risparmiando cellule normali / sane)1 mentre inducono l’immunità antitumorale2. Il virus dell’herpes simplex oncolitico (oHSV) è uno dei virus più studiati tra tutti gli UV. È più lontano lungo la clinica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) che è il primo e unico OV a ricevere l’approvazione della FDA negli Stati Uniti per il trattamento del melanoma avanzato3. Oltre al T-VEC, molti altri OHSV geneticamente modificati sono in fase di test preclinicamente e clinicamente in diversi tipidi cancro 3,4,5,6,7,8. L’attuale biotecnologia avanzata del DNA ricombinante ha ulteriormente aumentato la fattibilità dell’ingegneria di nuovi oHSV codificanti per transgeni terapeutici3,5. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione del tintore oHSV è fondamentale prima che qualsiasi oHSV (di nuova sviluppo) possa essere testato per studi in vitro e in vivo. Questo documento descrive un semplice metodo passo-passo di crescita oHSV (nelle cellule vero), purificazione (con il metodo del gradiente di saccarosio) e titolazione (mediante un saggio di placca oHSV nelle cellule Vero)(Figura 1). Può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio biosicurezza di livello 2 (BSL2) per ottenere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.

Vero, una linea di cellule renali di scimmia verde africana, è la linea cellulare più comunemente usata per la propagazione oHSV9,10,11,12,13 poiché le cellule vero hanno una via di segnalazione dell’interferone antiviraledifettosa 14. Altre linee cellulari con stimolatore inattivato di geni interferoni (STING) possono essere utilizzate anche per la crescita oHSV12,13. Questo protocollo utilizza cellule Vero per la crescita oHSV e il test della placca. Dopo la propagazione, le cellule infettate da oHSV vengono raccolte, lisciviate e sottoposte a purificazione, in cui le cellule lisciviate vengono prima trattate con nucleasi benzonasi per degradare il DNA delle cellule ospiti, prevenire l’aggregazione acido-proteina nucleica e ridurre la viscosità del lisato cellulare. Poiché la corretta attivazione della benzonasi richiede spesso Mg2+,in questo protocollo 15 viene utilizzato1-2 mM MgCl2. I detriti delle cellule ospiti del llysato cellulare trattato con benzonasio vengono ulteriormente eliminati mediante filtrazione seriale prima della centrifugazione ad alta velocità del gradiente di saccarosio. Un cuscino viscoso per la soluzione di saccarosio al 25% aiuta a garantire un tasso più lento di migrazione del virus attraverso lo strato di saccarosio, lasciando componenti correlati alle cellule ospiti nel supernatante, migliorando così la purificazione e limitando la perdita di virus nel pellet16. L’oHSV purificato viene quindi titolato sulle cellule Vero e le placche virali vengono visualizzate da Giemsa chemacchia 17 o colorazione X-gal (per la codifica LacZ oHSV)18.

Protocol

1) crescita oHSV NOTA: Garantire l’approvazione del comitato istituzionale per la biosicurezza prima di lavorare con oHSV. Questo studio è stato condotto nell’ambito del protocollo IBC n. 18007 approvato. Mantenere le precauzioni BSL2: sbiancare tutte le pipette, le punte, i tubi e altri materiali che entrano in contatto con il virus. Spruzzare guanti con 70% di alcol isopropile prima che le mani lascino il cappuccio di coltura cellulare BSL2. Lavarsi sempre accuratamente le mani con acqua di s…

Representative Results

Una breve panoramica dell’intero protocollo è illustrata nella figura 1, che rappresenta i passaggi critici coinvolti nella crescita, purificazione e titolazione di oHSV. Cpe nelle cellule vero può essere rilevato già 4 h infezione post-HSV19. La figura 2 mostra cpe nelle cellule Vero in tre diversi punti di tempo a seguito dell’infezione da oHSV. Il livello del CPE è aumentato nel tempo. In questo protocollo, il 90-100% cpe è solita…

Discussion

Il protocollo inizia con la crescita di oHSV nelle cellule vero a basso passaggio. La confluenza del monostrato a cellule Vero dovrebbe essere ~80% al momento dell’inoculazione del virus in quanto le cellule invase possono sviluppare strutture fibrose strette che possono ridurre l’ingresso di oHSV nelle cellule Vero20. Una volta osservato il 90-100% cpe, il supernatante della coltura viene rimosso, le cellule vengono raccolte, rimescolate in VB /supernatante (vedi passaggio 1.4.6), congelate a sca…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca nel laboratorio saha è stata supportata in parte da fondi del DIPARTIMENTO (W81XWH-20-1-0702) e della Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey erano parzialmente supportati da NIH (R01 CA160762).

Materials

1.7 mL centrifuge tubes Sigma CLS3620
15 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352097
5 mL polypropylene tubes Falcon 352063
50 mL polypropylene centrifuge tubes Falcon 352098
6-well cell culture plates Falcon 353046
Benzonase Nuclease Sigma E8263-25KU
Cell scraper Fisher Scientific 179693
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Corning MT-10-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Corning MT-21-031-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH3007003
Giemsa Stain Sigma G3032
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
Glycerol Sigma G5516
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Corning MT-21-021-CV
High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline Sigma D4031
Human immune globulin Gamastan NDC 13533-335-12
Magnesium chloride Fisher Chemical M33-500
Media Sterilization filter, 250 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25E
Media Sterilization filter, 500 mL Nalgene, Fisher Scientific 09-740-25C
Neutral Red solution Sigma N4638
Paraformaldehyde Fisher scientific  15710S
Plate rocker Fisher 88861043
Potassium Ferricyanide Sigma P8131
Potassium Ferrocyanide Sigma P9387
Sodium chloride Fisher Chemical S271-3
Sorvall ST 16R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004381
Sorvall ST 21R Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002446
Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-371
Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Syringe Filter, 0.45 PVDF MilliporeSigma SLHV033RS
Syringe Filter, 0.8 MCE MilliporeSigma SLAA033SS
Syringe filter, 5 µm PVDF MilliporeSigma SLSV025LS
T150 culture flask Falcon 355001
Tris-HCl MP Biomedicals LLC 816116
Ultrasonic water bath Branson CPX-952-116R
X-gal Corning 46-101-RF

Referências

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Citar este artigo
Nguyen, H., Sah, N., Humphrey, M. R. M., Rabkin, S. D., Saha, D. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (171), e62677, doi:10.3791/62677 (2021).

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