ओंकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस का विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन
Summary
इस पांडुलिपि में, हम प्रीक्लिनिकल उपयोग के लिए ऑन्कोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस के विकास, शुद्धिकरण और टिटरेशन की एक सरल विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
ओंकोलिटिक वायरस (ओवी), जैसे ऑनकोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस (ओएचएसवी), कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में तेजी से बढ़ती उपचार रणनीति है। OHSV सहित OVs, चुनिंदा में दोहराने और कैंसर की कोशिकाओं को मारने (स्वस्थ बख्शते/सामांय कोशिकाओं) जबकि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा उत्प्रेरण । इन अद्वितीय गुणों के कारण, ओएचएसवी-आधारित उपचार रणनीतियों का उपयोग कैंसर के उपचार के लिए तेजी से किया जा रहा है, जो एफडीए-अनुमोदित टैलिमोजीन लाहरपरेवेक (टी-वीईसी) सहित कैंसर, प्रीक्लिनिकली और चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जा रहा है। विकास, शुद्धिकरण, और titration किसी भी OVs के लिए तीन आवश्यक प्रयोगशाला तकनीकों, oHSVs सहित, इससे पहले कि वे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है । यह पेपर वेरो कोशिकाओं में ओएचएसवी को बढ़ाने के लिए एक सरल कदम-दर-कदम विधि का वर्णन करता है। ओएचएसवी गुणा के रूप में, वे वेरो कोशिकाओं में एक साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का उत्पादन करते हैं। एक बार 90-100% संक्रमित कोशिकाएं सीपीई दिखाती हैं, उन्हें धीरे-धीरे काटा जाता है, बेंजोनास और मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2)के साथ इलाज किया जाता है, और सुक्रोज-रेडिएंट विधि का उपयोग करके शुद्धिकरण के अधीन होता है। शुद्धिकरण के बाद, संक्रामक oHSV (पट्टिका बनाने इकाइयों या PFUs के रूप में नामित) की संख्या वेरो कोशिकाओं में एक “पट्टिका परख” द्वारा निर्धारित किया जाता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग सेल संस्कृति में और वीवो पशु प्रयोगों में इन विट्रो अध्ययनों के लिए उच्च-टिटर ओएचएसवी स्टॉक तैयार करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
ओन्कोलिटिक वायरस (ओवी) कैंसर इम्यूनोथेरेपी का एक उभरता हुआ और अनूठा रूप है। OVs चुनिंदा में दोहराने और ट्यूमर कोशिकाओं (बख्शते सामांय/स्वस्थ कोशिकाओं)1 जबकि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा2inducing । ओन्कोलिटिक दाद सिंप्लेक्स वायरस (oHSV) सभी OVs के बीच सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन वायरस में से एक है। यह क्लिनिक में सबसे दूर है, तालिमोजीन लाहेरपरेप्वेक (टी-वीईसी) उन्नत मेलानोमा3के उपचार के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने वाला पहला और एकमात्र OV है। टी-वीईसी के अलावा, कई अन्य आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ओएचएसवी का विभिन्न कैंसरप्रकार3,4, 5,6,7,8में पूर्व-कैंसर और चिकित्सकीय रूप से परीक्षण किया जा रहा है। वर्तमान उन्नत पुनः संयोजन डीएनए जैव प्रौद्योगिकी ने चिकित्सीय ट्रांसजीन (एस)3,5के लिए नए ओएचएसवी कोडिंग इंजीनियरिंग की व्यवहार्यता को और बढ़ा दिया है। ओएचएसवी प्रचार, शुद्धिकरण और टाइटर दृढ़ संकल्प की एक कुशल प्रणाली महत्वपूर्ण है इससे पहले कि किसी भी (नव विकसित) ओएचएसवी को इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के लिए परीक्षण किया जा सके। यह पेपर ओएचएसवी विकास (वेरो कोशिकाओं में), शुद्धिकरण (सुक्रोज-ढाल विधि द्वारा), और टिटरेशन (वेरो कोशिकाओं में ओएचएसवी पट्टिका परख द्वारा)(चित्र 1)की एक सरल चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करता है। इसे प्रीक्लीनिकल अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले वायरल स्टॉक को प्राप्त करने के लिए किसी भी बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल 2) प्रयोगशाला सेटिंग में आसानी से अपनाया जा सकता है।
वेरो,एक अफ्रीकी ग्रीन मंकी किडनी सेल लाइन, ओएचएसवी प्रचार9,10, 11, 12,13के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइन है क्योंकि वेरो कोशिकाओं में दोषपूर्ण एंटीवायरल इंटरफेरॉन सिग्नलिंग पाथवे14है। इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) सिग्नलिंग के निष्क्रिय उत्तेजक के साथ अन्य कोशिका रेखाओं का उपयोग ओएचएसवी विकास12,13के लिए भी किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल ओएचएसवी विकास और पट्टिका परख के लिए वेरो कोशिकाओं का उपयोग करता है। प्रचार-प्रसार के बाद ओएचएसवी संक्रमित कोशिकाओं को काटा जाता है, उन्हें शुद्धिकरण के अधीन किया जाता है, जिसमें lysed कोशिकाओं को पहले मेजबान कोशिका डीएनए को नीचा दिखाने के लिए बेंजोनास नाभिक के साथ इलाज किया जाता है, नाभिक एसिड-प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकता है, और कोशिका की चिपचिपाहट को कम करता है। चूंकि बेंजोनेज की उचित सक्रियता के लिए अक्सर एमजी2+की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल 15 में 1-2 एमएमएम एमजीसीएल2 का उपयोग कियाजाताहै। बेंजोनासे-इलाज सेल लिस्लेट से मेजबान सेल मलबे को हाई-स्पीड सुक्रोज-रेडिएंट अपकेंद्री से पहले सीरियल फिल्ट्रेशन द्वारा और खत्म कर दिया जाता है । एक चिपचिपा 25% सुक्रोज समाधान तकिया सुक्रोज परत के माध्यम से वायरस माइग्रेशन की धीमी दर सुनिश्चित करने में मदद करता है, जिससे सुपरनैंट में मेजबान सेल से संबंधित घटकों को छोड़ दिया जाता है, इस प्रकार गोली16में शुद्धिकरण और सीमित वायरस के नुकसान में सुधार होता है। शुद्ध oHSV तो वेरो कोशिकाओं पर titrated है, और वायरल सजीले टुकड़े Giemsa धुंधला17 या एक्स लड़की धुंधला (LacZ encoding oHSVs के लिए)18द्वारा कल्पना कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल कम मार्ग वेरो कोशिकाओं में oHSV के विकास के साथ शुरू होता है । वेरो सेल मोनोलेयर की घुलनशीलता वायरस टीका के समय ~ 80% होनी चाहिए क्योंकि अधिक विकसित कोशिकाएं तंग रेशेदार संरचनाएं विकसित कर सकती है…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
साहा लैब में अनुसंधान को डीओडी (W81XWH-20-1-0702) और चकमा जोंस फाउंडेशन-एबिलीन से धन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । सैमुअल डी रब्किन और मेलिसा आर.M हम्फ्रे को एनआईएच (R01 CA160762) द्वारा आंशिक रूप से समर्थन दिया गया था।
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
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