Cet article fournit une méthodologie détaillée pour la mesure des isolévuglandines dans les tissus par immunofluorescence à l’aide d’anticorps ScFv D11 conjugués à la phosphatase alcaline. Des modèles d’hypertension chez la souris et l’homme sont utilisés pour expliquer les procédures étape par étape et les principes fondamentaux associés à la mesure de l’isolévuglandine dans des échantillons de tissus.
Les isolevuglandines (IsoLGs) sont des gamma cétoaldéhydes hautement réactifs formés à partir d’isoprostanes H2 par peroxydation lipidique et protéines de réticulation conduisant à l’inflammation et à diverses maladies, y compris l’hypertension. La détection de l’accumulation d’IsoLG dans les tissus est cruciale pour faire la lumière sur leur implication dans les processus de la maladie. Cependant, la mesure des IsoLGs dans les tissus est extrêmement difficile, et les outils actuellement disponibles, y compris l’analyse par spectrométrie de masse, sont laborieux et extrêmement coûteux. Nous décrivons ici une nouvelle méthode de détection in situ des IsoLGs dans les tissus à l’aide de D11 ScFv conjugué à la phosphatase alcaline et d’un anticorps phage-affichage recombinant produit chez E. coli par microscopie immunofluorescente. Quatre témoins ont été utilisés pour valider la coloration : (1) coloration avec et sans D11, (2) coloration avec un extrait périplasmique bactérien avec le liant phosphatase alcalin, (3) coloration non pertinente des anticorps scFV et (4) contrôle compétitif avec IsoLG avant la coloration. Nous démontrons l’efficacité de la phosphatase alcaline conjuguée D11 dans les tissus humains et murins avec ou sans hypertension. Cette méthode servira probablement d’outil important pour étudier le rôle des IsoLG dans une grande variété de processus pathologiques.
Les isolévuglandines (IsoLG), également appelées isocétals, sont des isomères de la famille des 4-cétoaldéhydes, qui sont des produits de la peroxydation lipidique et réagissent avec les amines primaires sur les protéines 1,2. Les IsoLG ont été impliqués dans plusieurs maladies, notamment les maladies cardiovasculaires, la maladie d’Alzheimer, les maladies pulmonaires et hépatiques et de nombreux types de cancer3. Les IsoLG ont fait l’objet d’études plus approfondies pour leur contribution aux maladies cardiovasculaires (MCV), qui représentent un fardeau sanitaire et économique important à l’échelle mondiale, y compris aux États-Unis. On estime que 92,1 millions d’adultes américains ont au moins un type de MCV, avec des projections estimées pour 2030 atteignant 43,9% de la population adulte américaine4. L’abaissement de la pression artérielle, du cholestérol et du sevrage tabagique réduit le risque global et la survenue d’événements cardiovasculaires5.
L’hypertension artérielle ou l’hypertension est un facteur de risque majeur de maladie cardiovasculaire et touche environ la moitié de la population américaine6. Des études antérieures ont montré que l’inflammation est une cause sous-jacente de l’hypertension et que les IsoLG jouent un rôle7. Les stimuli hypertenseurs, y compris l’angiotensine II, les catécholamines, l’aldostérone et l’excès de sel alimentaire, induisent une accumulation d’IsoLG dans les cellules présentatrices d’antigènes, y compris les cellules dendritiques (DC), qui à leur tour activent les cellules T pour proliférer et produire des cytokines inflammatoires qui contribuent à l’hypertension 8,9.
Auparavant, les IsoLG ont été mesurés par immunohistochimie, spectrométrie de masse, dosage immuno-enzymatique et cytométrieen flux 10,11. Pour faciliter la mesure des IsoLGs, un anticorps recombinant à fragment à chaîne unique (scfv) (D11) a été développé contre IsoLGs12. Initialement, cet anticorps D11 contenait un E-tag de 11 acides aminés et nécessitait un anticorps secondaire pour la détection immunohistochimique11. Cependant, il a été difficile de trouver un anticorps secondaire fiable contre le E-tag après l’arrêt de sa production par le fabricant. Par conséquent, nous avons développé un protocole fiable pour la coloration immunofluorescente des IsoLGs en utilisant D11 conjugué avec la phosphatase alcaline (D11-AP), que nous avons démontré dans les tissus de souris et humains avec et sans hypertension.
Le D11 a été largement utilisé pour détecter les protéines adduites à IsoLG dans les cellules ou les tissus en tant que marqueur de l’inflammation ou du stress oxydatif dans la maladie 8,9,20. Auparavant, D11 contenait une étiquette E et le développement de l’IHC nécessitait l’utilisation d’un anticorps anti-E secondaire conjugué avec HRP10,20,21. Ici, nous avons développé et optimisé un protocole de détection des protéines adduites à IsoLG en utilisant l’anticorps D11 conjugué à la phosphatase alcaline à la place du E-tag, ce qui élimine le besoin d’une incubation d’anticorps secondaires.
Pour déterminer la spécificité du D11-AP, quatre expériences de contrôle négatif ont été réalisées. Nous avons effectué le protocole sans la présence de D11 et avons eu un développement minimal. Ces résultats ont une double indication : la phosphatase alcaline endogène ne contribue pas au développement, et la coloration observée est due à D11 et non à un autre facteur contributif. Ensuite, nous avons coloré les diapositives avec l’éditeur de liens AP sans D11. Cette expérience a entraîné peu de coloration, ce qui indique que l’AP libre ou d’autres facteurs dans l’extrait périplasmique ne causent pas la tache que nous observons en présence de D11. Pour assurer la spécificité du D11 à IsoLG, nous avons préincubé le D11-AP avec de l’IsoLG purifié avant de colorer les lames. Nous avons constaté une diminution du développement qui indique que le D11-AP était lié à la protéine IsoLG, épuisant ainsi la quantité de D11-AP libre à lier à IsoLG présente dans le tissu. Enfin, pour nous assurer que D11-AP se liait à IsoLG et non à la protéine MSA à laquelle IsoLG était lié, nous avons préincubé le D11-AP avec MSA uniquement. Il n’y a eu aucun changement dans le développement, indiquant que D11-AP n’était pas lié à MSA mais à la protéine IsoLG. Enfin, les chercheurs qui ont développé le protocole de coloration étaient aveugles à l’état hypertendu du tissu intestinal humain. Les différences de coloration observées entre les patients hypertendus et les patients atteints de normotension n’étaient pas dues à un biais et ont été décritesprécédemment 22,23.
Bien que notre protocole de détection des protéines adduites à IsoLG à l’aide de l’anticorps D11 conjugué à la phosphatase alcaline à la place de l’E-tag soit rigoureux et robuste et élimine le besoin d’une incubation d’anticorps secondaires, il présente certaines limites. Une limitation est que nous avons utilisé D11 conjugué avec la phosphatase alcaline dans l’extrait périplasmique, et il pourrait y avoir une fausse coloration de la phosphatase alcaline endogène dans l’extrait périplasmique ou certains tissus, tels que l’intestin24. Cependant, la première étape pour développer ce protocole comprenait la désactivation de la phosphatase alcaline endogène qui peut être présente dans les tissus25. Initialement, l’acide acétique froid, le BME et le lévamisole26 ont été testés pour leur efficacité. Aucun d’entre eux n’a complètement diminué la présence de phosphatase alcaline endogène active. La chaleur a été utilisée pour désactiver la phosphatase alcaline27, nous avons donc testé la désactivation thermique de la phosphatase alcaline dans différents tampons. Nous avons constaté que les lames chauffées montées et hydratées dans le tampon de citrate éliminaient la plupart des phosphatases alcalines endogène. Les lames ont été développées initialement en utilisant un substrat chimiluminescent / fluorescent, mais lorsqu’elles ont été imagées sans ce substrat, il y avait une grande quantité d’autofluorescence. VectorRed est un substrat qui se développe en présence de phosphatase alcaline pour produire un chromogène qui peut être visualisé dans la gamme de canaux Texas Red/TRITC. En utilisant ce substrat, nous avons pu observer plus facilement le signal au-dessus de l’autofluorescence de fond. Des précautions doivent être prises pendant le processus de coloration pour minimiser la coloration artificielle. Séchage des tissus sur lames après l’hydratation jusqu’à ce que l’imagerie ait entraîné un développement accru. Le D11-AP doit être aliquote et conservé à -20 °C. Les cycles multiples de gel-dégel doivent être évités lorsque vous travaillez avec D11-AP. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) peut également affecter l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline et ne doit pas être utilisée comme tampon de lavage28. Comme pour toute approche basée sur les anticorps, des tests et une optimisation approfondis doivent être effectués pour s’assurer que la coloration est spécifique et que le signal n’est pas trop ou sous-amplifié.
En conclusion, nous avons développé un protocole optimisé puissant, rigoureux et robuste pour détecter les protéines adduites par IsoLG en utilisant l’anticorps D11 conjugué à la phosphatase alcaline à la place de l’E-tag. Ce protocole présente plusieurs avantages : premièrement, l’utilisation de D11 comme protéine de fusion de phosphatase alcaline est moins chère. D11 était à l’origine dérivé d’une bibliothèque d’anticorps de phages qui ne pouvait pas être commercialisée et était coûteuse à purifier. Bien que D11 dans l’extrait périplasmique d’E. coli puisse fournir une alternative peu coûteuse, il était inefficace dans la plupart des essais. Deuxièmement, l’approche de fusion de la phosphatase alcaline permet au D11 scfv d’avoir un rapporteurutile 15 (phosphatase alcaline) fusionné et n’aurait pas besoin d’être purifié pour être utilisé dans des immunoessais car les substrats sont disponibles dans le commerce. Troisièmement, la phosphatase alcaline E. coli forme des dimères29. Ainsi, D11, lorsqu’il est fusionné à la phosphatase alcaline, formerait également des dimères, ce qui augmenterait l’avidité et l’activité de liaison de l’anticorps30. Enfin, le D11 conjugué à la phosphatase alcaline dans un extrait périplasmique peut facilement être nettoyé à l’aide de Séphararose bleu de Cibacron. D11 a un point isoélectrique élevé (~9,2 pH). En tant que tel, il est chargé positivement et peut se lier au bleu de cibacron par des interactions pi-cation. La plupart des impuretés contenues dans l’extrait périplasmique d’E. coli peuvent être éluées de la résine. Le D11 conjugué à la phosphatase alcaline peut ensuite être élué à l’aide de sel élevé (~1,5M NaCl) dans l’eau. Le D11 élué conjugué à la phosphatase alcaline est assez stable à 4-8 °C dans la solution à haute teneur en sel. Ainsi, nous avons développé un protocole qui non seulement rend l’anticorps D11 disponible à faible coût, mais élimine également les étapes supplémentaires et la nécessité de l’incubation de l’anticorps secondaire. Ce protocole facilite la mesure reproductible des IsoLG, qui s’accumulent dans les tissus de multiples maladies où l’augmentation du stress oxydatif joue un rôle.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les subventions K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 et R03HL155041 des National Institutes of Health à A.K. Nous remercions la ressource partagée en cardiologie numérique – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 pour la visualisation et la numérisation des diapositives.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |