Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor de meting van isolevuglandinen in weefsels door immunofluorescentie met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde ScFv D11-antilichamen. Hypertensiemodellen bij zowel muizen als mensen worden gebruikt om de stapsgewijze procedures en fundamentele principes uit te leggen die verband houden met isolevuglandinemeting in weefselmonsters.
Isolevuglandinen (IsoLGs) zijn zeer reactieve gamma-ketoaldehyden gevormd uit H2-isoprostanen door lipideperoxidatie en crosslink-eiwitten die leiden tot ontsteking en verschillende ziekten, waaronder hypertensie. Detectie van IsoLG-accumulatie in weefsels is cruciaal om licht te werpen op hun betrokkenheid bij de ziekteprocessen. Het meten van IsoLGs in weefsels is echter uiterst moeilijk en de momenteel beschikbare hulpmiddelen, waaronder massaspectrometrie-analyse, zijn arbeidsintensief en extreem duur. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor in situ detectie van IsoLGs in weefsels met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde D11 ScFv en een recombinant faag-display antilichaam geproduceerd in E. coli door immunofluorescente microscopie. Vier controles werden gebruikt voor het valideren van de kleuring: (1) kleuring met en zonder D11, (2) kleuring met bacterieel periplasmatisch extract met de alkalische fosfataselinker, (3) irrelevante scFV-antilichaamkleuring en (4) concurrerende controle met IsoLG voorafgaand aan de kleuring. We tonen de effectiviteit aan van de alkalische fosfatase-geconjugeerde D11 in zowel menselijke als muisweefsels met of zonder hypertensie. Deze methode zal waarschijnlijk dienen als een belangrijk hulpmiddel om de rol van IsoLGs in een breed scala van ziekteprocessen te bestuderen.
Isolevuglandinen (IsoLGs), ook bekend als isoketalen, zijn isomeren van de 4-ketoaldehydefamilie, die producten zijn van lipideperoxidatie, en reageren met en adducteren naar primaire amines op eiwitten 1,2. IsoLGs zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder cardiovasculaire, Alzheimer, long- en leverziekten en vele soorten kanker3. IsoLGs zijn het meest uitgebreid bestudeerd in hun bijdrage aan hart- en vaatziekten (CVD), wat wereldwijd een aanzienlijke gezondheids- en economische last is, inclusief de Verenigde Staten. Er wordt geschat dat 92,1 miljoen Amerikaanse volwassenen ten minste één type HVZ hebben, met geschatte projecties voor 2030 die oplopen tot 43,9% van de Amerikaanse volwassen bevolking4. Het verlagen van de bloeddruk, cholesterol en stoppen met roken vermindert het algehele risico en het optreden van CVD-gebeurtenissen5.
Hoge bloeddruk of hypertensie is een belangrijke risicofactor voor hart- en vaatziekten en treft ongeveer de helft van de Amerikaanse bevolking6. Eerdere studies hebben aangetoond dat ontsteking een onderliggende oorzaak is van hypertensie en dat IsoLGs een rol spelen7. Hypertensieve stimuli, waaronder angiotensine II, catecholamines, aldosteron en overtollig voedingszout, induceren IsoLG-accumulatie in antigeen presenterende cellen, waaronder dendritische cellen (DC’s), die op hun beurt T-cellen activeren om te prolifereren en inflammatoire cytokines te produceren die bijdragen aan hypertensie 8,9.
Eerder werden IsoLGs gemeten door immunohistochemie, massaspectrometrie, enzymgebonden immunosorbenttest en flowcytometrie10,11. Om de meting van IsoLGs te vergemakkelijken, werd een single-chain fragment variable (scfv) recombinant antilichaam (D11) ontwikkeld tegen IsoLGs12. Aanvankelijk bevatte dit D11-antilichaam een 11-aminozuur E-tag en was een secundair antilichaam nodig voor immunohistochemische detectie11. Het was echter moeilijk om een betrouwbaar secundair antilichaam tegen de E-tag te vinden na het staken van de productie door de fabrikant. Daarom hebben we een betrouwbaar protocol ontwikkeld voor immunofluorescente kleuring van IsoLGs met behulp van D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase (D11-AP), dat we hebben aangetoond in muizen- en menselijke weefsels met en zonder hypertensie.
D11 is op grote schaal gebruikt om IsoLG-geadduceerde eiwitten in cellen of weefsels te detecteren als een marker voor ontsteking of oxidatieve stress bij ziekte 8,9,20. Voorheen bevatte D11 een E-tag en IHC-ontwikkeling vereiste het gebruik van een secundair anti-E-tag-antilichaam geconjugeerd met HRP10,20,21. Hier hebben we een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de detectie van IsoLG-geadduceerde eiwitten met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag, waardoor een secundaire antilichaamincubatie niet meer nodig is.
Om de specificiteit van D11-AP te bepalen, werden vier negatieve controle-experimenten uitgevoerd. We voerden het protocol uit zonder de aanwezigheid van D11 en hadden minimale ontwikkeling. Deze resultaten hebben een tweevoudige indicatie: endogene alkalische fosfatase draagt niet bij aan de ontwikkeling en de waargenomen kleuring is te wijten aan D11 en niet aan een andere bijdragende factor. Vervolgens hebben we dia’s gekleurd met de AP-linker zonder D11. Dit experiment resulteerde in weinig kleuring, wat aangeeft dat vrije AP of andere factoren in het periplasmatische extract niet de vlek veroorzaken die we waarnemen in de aanwezigheid van D11. Om de specificiteit van D11 naar IsoLG te garanderen, hebben we D11-AP voorgeïncubeerd met gezuiverde IsoLG voordat we dia’s kleurden. We zagen een afname in de ontwikkeling die aangeeft dat de D11-AP gebonden was aan IsoLG-eiwit, waardoor de hoeveelheid vrije D11-AP om te binden aan IsoLG in het weefsel werd uitgeput. Ten slotte, om ervoor te zorgen dat D11-AP zich aan IsoLG bindde en niet aan het MSA-eiwit waaraan IsoLG was gebonden, hebben we D11-AP alleen met MSA voorgeïncubeerd. Er waren geen veranderingen in de ontwikkeling, wat aangeeft dat D11-AP niet bindend was aan MSA, maar aan het IsoLG-eiwit. Ten slotte waren onderzoekers die het kleuringsprotocol ontwikkelden blind voor de hypertensieve status van menselijk darmweefsel. De waargenomen verschillen in kleuring tussen patiënten met hypertensie en patiënten met normotensie waren niet te wijten aan bias en zijn eerder beschreven22,23.
Hoewel ons protocol voor de detectie van IsoLG-geadduceerde eiwitten met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag rigoureus en robuust is en de noodzaak van een secundaire antilichaamincubatie elimineert, heeft het enkele beperkingen. Een beperking is dat we D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase in het periplasmatische extract hebben gebruikt, en er kan valse kleuring van endogene alkalische fosfatase zijn in het periplasmatische extract of bepaalde weefsels, zoals darm24. De eerste stap om dit protocol te ontwikkelen omvatte echter het uitschakelen van endogene alkalische fosfatase die aanwezig kan zijn in weefsels25. Aanvankelijk werden koud azijnzuur, BME en Levamisole26 getest op efficiëntie. Geen van deze verminderde volledig de aanwezigheid van actieve endogene alkalische fosfatase. Warmte is gebruikt om alkalische fosfatase27 te deactiveren, dus we hebben warmtedeactivering van alkalische fosfatase in verschillende buffers getest. We vonden dat verwarming gemonteerde en gehydrateerde dia’s in citraatbuffer de meeste endogene alkalische fosfatase elimineerden. Dia’s werden aanvankelijk ontwikkeld met behulp van een chemiluminescent / fluorescerend substraat, maar wanneer ze zonder dit substraat werden afgebeeld, was er een hoge hoeveelheid autofluorescentie. VectorRed is een substraat dat zich ontwikkelt in de aanwezigheid van alkalische fosfatase om een chromogeen te produceren dat kan worden gevisualiseerd in het Texas Red / TRITC-kanaalbereik. Met behulp van dit substraat konden we gemakkelijker signaal waarnemen boven achtergrondautofluorescentie. Tijdens het kleuringsproces moet voorzichtig worden geweest om artefactuele vlekken te minimaliseren. Drogen van weefsels op dia’s na hydratatie totdat beeldvorming heeft geresulteerd in een verhoogde ontwikkeling. D11-AP moet worden gealiquoteerd en bewaard bij -20 °C. Meerdere vries-dooicycli moeten worden vermeden bij het werken met D11-AP. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) kan ook de enzymatische activiteit van alkalische fosfatase beïnvloeden en mag niet worden gebruikt als wasbuffer28. Zoals bij elke op antilichamen gebaseerde aanpak, moeten grondige tests en optimalisatie worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de kleuring specifiek is en dat het signaal niet over- of onderversterkt is.
Kortom, we hebben een krachtig, rigoureus en robuust geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om IsoLG-geadduceerde eiwitten te detecteren met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag. Dit protocol biedt verschillende voordelen: ten eerste is het gebruik van D11 als alkalisch fosfatasefusie-eiwit goedkoper. D11 was oorspronkelijk afgeleid van een faagantilichaambibliotheek die niet kon worden gecommercialiseerd en duur was om te zuiveren. Hoewel D11 in E. coli periplasmatisch extract een goedkoop alternatief kon bieden, was het in de meeste testen niet effectief. Ten tweede zorgt de alkalische fosfatasefusiebenadering ervoor dat D11 scfv een nuttige reporter15 (alkalische fosfatase) ermee versmolten en niet hoeft te worden gezuiverd voor gebruik in immunoassays omdat substraten in de handel verkrijgbaar zijn. Ten derde vormt de E. coli alkalische fosfatase dimeren29. Dus D11, wanneer gefuseerd met de alkalische fosfatase zou ook dimeren vormen en dit verhoogt de aviditeit en bindingsactiviteit van het antilichaam30. Ten slotte kan D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase in periplasmatisch extract gemakkelijk worden gereinigd met Cibacron Blue Sepharose. D11 heeft een hoog iso-elektrisch punt (~9,2 pH). Als zodanig is het positief geladen en kan het binden aan Cibacron Blue door pi-cation interacties. De meeste onzuiverheden in het E. coli periplasmatisch extract kunnen van de hars worden geëlueerd. De D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase kan vervolgens worden geëlueerd met behulp van hoog zout (~ 1,5 M NaCl) in water. Het geëlueerde D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase is vrij stabiel bij 4-8 °C in de zoutrijke oplossing. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld dat niet alleen het D11-antilichaam tegen lage kosten beschikbaar maakt, maar ook de extra stappen en noodzaak voor de secundaire antilichaamincubatie elimineert. Dit protocol vergemakkelijkt reproduceerbare meting van IsoLGs, die zich ophopen in weefsels bij meerdere ziekten waarbij verhoogde oxidatieve stress een rol speelt.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 en R03HL155041 aan A.K. We bedanken de Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 voor visualisatie en diascanning.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |