Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör
Summary
Det skisserade protokollet beskriver förfarandet för att producera HiBiT-receptor-bindande domänproteinkomplexet och dess tillämpning för snabb och känslig detektion av SARS-CoV-2 antikroppar.
Abstract
Uppkomsten av COVID-19-pandemin har ökat behovet av bättre serologiska detektionsmetoder för att fastställa den epidemiologiska effekten av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det ökande antalet SARS-CoV-2 infektioner ökar behovet av bättre antikroppsdetekteringsanalyser. Nuvarande antikroppsdetekteringsmetoder äventyrar känsligheten för hastighet eller är känsliga men tidskrävande. En stor andel sars-cov-2-neutraliserande antikroppar riktar sig mot det receptorbindande området (RBD), ett av de primära immunogena facken i SARS-CoV-2. Vi har nyligen designat och utvecklat en mycket känslig, bioluminescerande taggad RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar. I följande text beskrivs proceduren för att producera HiBiT-RBD-komplexet och en snabb analys för att utvärdera förekomsten av RBD-inriktade antikroppar med det här verktyget. På grund av hållbarheten hos HiBiT-RBD-proteinprodukten över ett brett spektrum av temperaturer och det kortare experimentella förfarandet som kan slutföras inom 1 h, kan protokollet betraktas som ett effektivare alternativ för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar i patientserumprover.
Introduction
Den senaste tidens uppkomst av ett nytt coronavirus, SARS-CoV21, har orsakat mer än 2 800 000 dödsfall och 128 miljoner infektioner per den 30 mars 20212. På grund av bristen på ett tillförlitligt och väletablerat behandlingsförfarande för sars-cov-2 kliniska terapier, många ansträngningar har gjorts för att begränsa ytterligare viral överföring och ännu viktigare, att utveckla en effektiv och robust behandling eller ett vaccin3. Hittills finns det mer än 50 COVID-19 vaccinkandidater i prövningar som rapporterats av Världshälsoorganisationen4. Påvisande av antikroppar mot SARS-CoV-2 är av största vikt för att fastställa den långsiktiga stabiliteten i humoral respons vid administrering av vaccinet samt hos tillfrisknade patienter med covid-195. Vissa studier har visat att det finns en möjlighet att tillfrisknade SARS- CoV-2-patienter förlorar de flesta av de RBD-bindande antikropparna efter 1 år5,6,7,8,9. Ytterligare undersökningar krävs för att bättre förstå varaktig immunitet, och känsligare antikroppsdetekteringsplattformar kan bidra till att främja sådant arbete. Rapporter om ihållande immunitet av milda SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på långsiktiga antikroppssvar, är också ett intressant och värdefullt studieområde. En snabb och exakt detektionsmetod är avgörande för övervakning av antikroppar i individers serum för att ge mer information om immunitet i befolkningen.
Liksom andra coronavirus använder SARS-CoV-2 utskjutande spikglykoprotein för att binda till angiotensinkonverterande enzym-2 (ACE2) för att initiera en kaskad av händelser som leder till fusion av virus- och cellmembranen6,7. Flera studier har nyligen visat att SPIKE-proteinets RBD har en avgörande roll för att framkalla kraftfullt och specifikt antikroppssvar mot SARS-CoV28,9,10,11. I synnerhet överensstämmer korrelationer som observerats av Premkumar et al. mellan titer av RBD-bindande antikropp och SARS-CoV-2 neutraliseringsstyrka hos patienternas plasma med RBD som ett immunogent fack i virusstrukturen9. Med detta i åtanke är många diagnostiska tester tillgängliga för sars-cov-2 antikroppsdetektering tids- och kostnadsintensiva, kräver ett långt förfarande för inkubation och tvätt (enzymlänkad immunosorbentanalys [ELISA]), eller saknar känslighet och noggrannhet (lateralt flöde immunoassay [LFIA])12. Därför skulle en kvantitativ och snabb kompletterande serologisk metod för covid-19-härledd antikroppsdetektering med hög känslighet, snabb respons och relativt låg kostnad tjäna behovet av ett tillförlitligt serologiskt test för sars-cov-2 epidemiologisk övervakning.
Sammantaget föranledde begränsningarna i nuvarande serologiska analyser undersökningen av det bioluminescerande rapporteringssystemet som ett potentiellt diagnostiskt medel i framtida serosurveys. Bioluminescens är en naturligt förekommande enzym-/substratreaktion, med ljusemission. Nanoluc luciferas är det minsta (19 kDa), men ändå det ljusaste systemet jämfört med Renilla och firefly luciferas (36 kDa respektive 61 kDa)13,14. Dessutom har Nanoluc det högsta signal-till-brusförhållandet och stabiliteten bland de tidigare nämnda systemen. Nanolucs höga signalintensitet stöder upptäckten av även mycket låga mängder reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) är en delad version av Nanoluc-systemet, som består av två segment: små BiT (11 aminosyror; SmBiT) och stor BiT (LgBiT) med relativt låg affinitet interaktioner (KD = 190 μM ) för att bilda ett självlysande komplex16. NanoBiT används i stor utsträckning i olika studier som involverar identifiering av protein-proteininteraktioner15,17,18,19 och cellulära signalvägar11,20,21.
Nyligen introducerades en annan liten peptid med en tydligt högre affinitet till LgBiT (KD = 0,7 nM ), nämligen HiBiT Nano-Glo-systemet, i stället för SmBiT. Nano-Glos analys av nano-glo “add-mix-read” gör HiBiT till en lämplig, kvantitativ, självlysande peptidtagg. I detta tillvägagångssätt läggs HiBiT-taggen till målproteinet genom att utveckla en konstruktion som medför minimal strukturell interferens. HibT-proteinfusion skulle aktivt binda till LgBiT-motsvarigheten och producera ett mycket aktivt luciferasenzym för att generera detekterbar bioluminescens i närvaro av detektionsreagenser (figur 1). På samma sätt utvecklade vi ett HiBiT Nano-Glo-baserat system för att enkelt mäta den neutraliserande antikroppstiter i serumet hos SARS-CoV-2 återvunna individer och utvecklade nyligen en HiBiT-märkt SARS-CoV-2 RBD. Detta dokument beskriver protokollet för att producera HiBiT-RBD bioreporter med hjälp av vanliga laboratorieprocedurer och utrustning, och visar hur denna bioreporter kan användas i en snabb och effektiv analys för att upptäcka SARS-CoV-2 RBD-mål antikroppar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det ökande antalet personer som smittats med SARS-CoV-2 och den pågående ansträngningen för global vaccination kräver känsliga och snabba serologiska tester som kan användas i storskaliga serosurveys. Ny forskning visar att split nanoluciferase-baserade biorapporter kan användas för att utveckla sådana analyser. Vi utvecklade nyligen HiBiT-RBD bioreporter för att utforma ett test som kan användas för att upptäcka SARS-CoV-2-specifika antikroppar i patientserum på ett snabbt och tillförlitligt sätt (<str…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppskattar och tackar den tekniska hjälpen från Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin och Christiano Tanese De Souza. Vi tackar också Mina Ghahremani för grafisk design. Vi vill också tacka alla individer som deltog och donerade sina blodprover för denna studie. DWC stöds delvis av uOttawa-fakulteten och Institutionen för medicin.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
Referências
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
