Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT
Summary
O protocolo delineado descreve o procedimento para a produção do complexo de proteína de domínio de ligação receptora HiBiT e sua aplicação para detecção rápida e sensível de anticorpos SARS-CoV-2.
Abstract
O surgimento da pandemia COVID-19 aumentou a necessidade de melhores métodos de detecção sorológica para determinar o impacto epidemiológico da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). O número crescente de infecções por SARS-CoV-2 aumenta a necessidade de melhores ensaios de detecção de anticorpos. Os métodos atuais de detecção de anticorpos comprometem a sensibilidade para a velocidade ou são sensíveis, mas demorados. Uma grande proporção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 tem como alvo o domínio de ligação receptora (RBD), um dos compartimentos imunogênicos primários do SARS-CoV-2. Recentemente projetamos e desenvolvemos um RBD altamente sensível, bioluminescente marcado (NanoLuc HiBiT-RBD) para detectar anticorpos SARS-CoV-2. O texto a seguir descreve o procedimento para produzir o complexo HiBiT-RBD e um ensaio rápido para avaliar a presença de anticorpos direcionados a RBD usando esta ferramenta. Devido à durabilidade do produto de proteína HiBiT-RBD em uma ampla gama de temperaturas e ao procedimento experimental mais curto que pode ser concluído dentro de 1 h, o protocolo pode ser considerado como uma alternativa mais eficiente para detectar anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.
Introduction
O recente surgimento de um novo coronavírus, SARS-CoV21, causou mais de 2.800.000 mortes e 128 milhões de infecções a partir de 30 de março de 20212. Devido à falta de um procedimento de tratamento confiável e bem estabelecido para as terapias clínicas SARS-CoV-2, muitos esforços têm sido feitos para restringir a transmissão viral e, mais importante, desenvolver um tratamento eficaz e robusto ou uma vacina3. Até o momento, há mais de 50 candidatos à vacina COVID-19 em ensaios relatados pela Organização Mundial da Saúde4. A detecção de anticorpos contra o SARS-CoV-2 é de suma importância para determinar a estabilidade a longo prazo da resposta humoral após a administração da vacina, bem como em pacientes recuperados de COVID-195. Alguns estudos demonstraram que existe a possibilidade de que pacientes recuperados de SARS-CoV-2 percam a maioria dos anticorpos de ligação de RBD após 1 ano5,6,7,8,9. Uma investigação mais aprofundada é necessária para entender melhor a imunidade duradoura, e plataformas de detecção de anticorpos mais sensíveis podem ajudar a continuar esse trabalho. Relatos de imunidade sustentada de infecções leves de SARS-CoV-2, que sugerem respostas de anticorpos a longo prazo, também é uma área de estudo interessante e valiosa. Um método rápido e preciso de detecção é essencial para o monitoramento de anticorpos na sera dos indivíduos para fornecer mais informações sobre imunidade na população.
Como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 usa glicoproteína de espigão saliente para se ligar à enzima conversor de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar uma cascata de eventos que levam à fusão das membranas virais e celulares6,7. Vários estudos provaram recentemente que o RBD da proteína Spike tem um papel crucial na obtenção de resposta de anticorpos poderosos e específicos contra SARS-CoV28,9,10,11. Em particular, as correlações observadas por Premkumar et al. entre o titer de anticorpos de ligação RBD e a potência de neutralização SARS-CoV-2 do plasma dos pacientes são consistentes com a RBD ser um compartimento imunogênico da estrutura do vírus9. Com isso em mente, muitos testes diagnósticos disponíveis para detecção de anticorpos SARS-CoV-2 são tempo e custo-intensivo, requerem um longo procedimento de incubação e lavagem (ensaio imunosorbente ligado à enzima [ELISA]), ou falta de sensibilidade e precisão (imunoensaio de fluxo lateral [LFIA])12. Portanto, um método sorológico quantitativo e rápido complementar da detecção de anticorpos derivados do COVID-19 com alta sensibilidade, resposta rápida e custo relativamente baixo serviria à necessidade de um teste sorológico confiável para a vigilância epidemiológica SARS-CoV-2.
Coletivamente, as limitações dos ensaios sorológicos atuais levaram à investigação do sistema de relatórios bioluminescentes como um potencial agente diagnóstico em futuras pesquisas. Bioluminescência é uma reação enzimática/substrato de ocorrência natural, com emissão de luz. A luciferase nanoluc é a menor (19 kDa), mas o sistema mais brilhante comparado à Renilla e à luciferase de vagalume (36 kDa e 61 kDa, respectivamente)13,14. Além disso, a Nanoluc tem a maior relação de sinal para ruído e estabilidade entre os sistemas mencionados anteriormente. A alta intensidade de sinal de Nanoluc suporta a detecção de quantidades ainda muito baixas de fusões de repórteres15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) é uma versão dividida do sistema Nanoluc, que é composto por dois segmentos: pequeno BiT (11 aminoácidos; SmBiT) e biT grande (LgBiT) com interações relativamente baixas de afinidade (KD = 190 μM ) para formar um complexo luminescente16. O NanoBiT é amplamente utilizado em diversos estudos envolvendo a identificação de interações proteína-proteína15,17,18,19 e vias de sinalização celular11,20,21.
Recentemente, outro pequeno peptídeo com uma afinidade distintamente maior com o LGBiT (KD = 0,7 nM ) foi introduzido, ou seja, o sistema HiBiT Nano-Glo, no lugar do SmBiT. A alta afinidade e o forte sinal do ensaio “add-mix-read” de Nano-Glo fazem do HiBiT uma etiqueta de peptídeo adequada, quantitativa e luminescente. Nesta abordagem, a tag HiBiT é anexada à proteína alvo, desenvolvendo uma construção que impõe interferência estrutural mínima. A fusão hiBiT-proteína se ligaria ativamente à contraparte lgBiT, produzindo uma enzima luciferase altamente ativa para gerar bioluminescência detectável na presença de reagentes de detecção (Figura 1). Da mesma forma, desenvolvemos um sistema baseado em HiBiT Nano-Glo para medir prontamente o titer de anticorpos neutralizante na sera de indivíduos recuperados SARS-CoV-2 e recentemente desenvolvemos um SARS-CoV-2 RBD com marca HiBiT. Este artigo descreve o protocolo para a produção do bioreporter HiBiT-RBD usando procedimentos e equipamentos de laboratório padrão, e mostra como este biorelato pode ser usado em um ensaio rápido e eficiente para detectar anticorpos alvo SARS-CoV-2 RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
O número crescente de pessoas infectadas com o SARS-CoV-2 e o esforço contínuo para a vacinação global exigem testes sorológicos sensíveis e rápidos que podem ser usados em serosurveys em larga escala. Pesquisas recentes mostram que bionotáciferas com base em nanoluciferase divididos podem ser usados para desenvolver tais ensaios. Recentemente desenvolvemos o bioreporter HiBiT-RBD para projetar um teste que pode ser usado para detectar anticorpos específicos SARS-CoV-2 no soro do paciente de forma rápida e con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos e agradecemos a assistência técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Agradecemos também a Mina Ghahremani pelo Design Gráfico. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo. A DWC é apoiada em parte pela Faculdade uOttawa e pelo Departamento de Medicina.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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