Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi
Summary
Aspergillus fumigatus conidia’nın (3 μm boyutunda) farelerin hava yollarında dağılımının nicel analizi için yöntemi açıklıyoruz. Yöntem ayrıca çeşitli patolojik durum modellerinde hava yollarındaki mikropartiküllerin ve nanopartikül aglomera dağılımının analizi için de kullanılabilir.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia, insan hava yollarına nüfuz edelim diye hava yoluyla bulaşan patojenlerdir. Alerjisi olmayan bağışıklık sistemi yetersiz kişiler direnç ve immünolojik tolerans sergilerken, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda konidia hava yollarını kolonize edebilir ve ciddi invaziv solunum bozukluklarına neden olabilir. Farklı hava yolu bölmelerindeki çeşitli hücreler, mantar istilasını önleyen bağışıklık tepkisine dahil edilir; bununla birlikte, patojen eliminasyonunun mekansal-zamansal yönleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Optik olarak temizlenmiş tüm montajlı organların, özellikle deneysel farelerin akciğerlerinin üç boyutlu (3D) görüntülenmesi, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında floresan etiketli patojenlerin hava yollarında tespit edilmesine izin veriyor. Bu çalışmada, hava yollarındaki A. fumigatus conidia dağılımının nicel bir analizini yapmak için deneysel bir kurulum tarif ediyoruz. Floresan konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullanarak, farelere orofarengeal uygulamadan 6 saat sonra bronş dallarında ve alveolar bölmede floresan etiketli konidianın yerini takip ettik. Burada açıklanan yaklaşım daha önce kesin patojen yerinin tespiti ve patojenle etkileşime giren hücrelerin bağışıklık yanıtının farklı aşamalarında tanımlanması için kullanılmıştır. Deneysel kurulum, patojen eliminasyonunun kinetiğini farklı patolojik koşullarda tahmin etmek için kullanılabilir.
Introduction
Günlük olarak, insanlar solunum yollarına nüfuz ürebilen fırsatçı mantarlar Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) sporları da dahil olmak üzere havadaki patojenleri solurlar1. Memelilerin solunum yolu, hava yolu duvarlarının farklı yapıları ile karakterize edilen farklı nesillerin hava yolları sistemidir2,3,4. Trakeobronşiyal duvarlar, mukozitary boşluğu sağlayan siliated hücreler olan çeşitli hücre tiplerinden oluşur5. Alveollerde, siliated hücre yoktur ve nüfuz eden alveolar uzay patojenleri mukozir boşluk6ile ortadan kaldırılamaz. Ayrıca, her hava yolu üretimi birden fazla bağışıklık hücresi popülasyonu için bir niştir ve bu popülasyonların alt kümeleri belirli hava yolu bölmeleri için benzersizdir. Bu nedenle, alveolar makrofajlar alveolar bölmelerde bulunurken, hem trakea hem de iletken hava yolları intraepithelial dendritik hücreler7,8ile kaplıdır.
A. fumigatus conidia’nın yaklaşık büyüklüğü 2-3,5 μm9’dur. İnsanlarda ve hatta farelerde küçük hava yollarının çapı 3,5 μm’yi aştığından, conidia’nın alveolar alana2, 10,11nüfuz edebileceği öne sürüldü. Aslında, histolojik muayene aspergillosis muzdarip hastaların alveollerinde mantar büyümesini gösterdi12. Conidia ayrıca kalın akciğer dilimlerinin canlı görüntülemesi kullanılarak enfekte farelerin alveollerinde tespit edildi13. Aynı zamanda, farelerin bronş epitelinin aydınlık tarafında konidia tespit edildi14.
Optik olarak temizlenmiş tam mount fare akciğerlerinin üç boyutlu (3D) görüntülenmesi, hava yollarının morfometrik analizine izin sağlar15. Özellikle, viseral plevral sinir dağılımının nicel analizi optik olarak temizlenmiş fare akciğer örnekleri kullanılarak gerçekleştirildi15. Son zamanlarda, Amich ve ark.16, optik olarak temizlenmiş fare akciğer örneklerinin ışık tabakası floresan mikroskopisi kullanılarak immün sistemi baskılanmış farelere konidia intranazal uygulamasından sonra mantar büyümesini araştırdı. Enfeksiyondan sonra solunum yollarındaki istirahat konidiasının farklı zaman noktalarında kesin konumu, iltihabın belirli aşamalarında yeterli antifungal savunma sağlayabilen hücre popülasyonlarının tanımlanması için önemlidir. Bununla birlikte, nispeten küçük boyut nedeniyle, hava yollarındaki A. fumigatus conidia dağılımının mekansal-zamansal yönleri kötü karakterizedir.
Burada, enfekte farelerin hava yollarında A. fumigatus conidia dağılımının nicel analizi için deneysel bir kurulum sunuyoruz. Floresan etiketli A. fumigatus conidia’nın orofarengeal uygulamasını alan farelerin optik olarak temizlenmiş akciğerlerinin floresan konfokal lazer tarama mikroskopisini (CLSM) kullanarak 3D görüntüler elde ediyor ve görüntü işlemeyi gerçekleştiriyoruz. Tüm monte akciğer lobunun 3D görüntülemesini kullanarak, daha önce conidia uygulamasından 72 saat sonra farelerin iletken hava yolunda A. fumigatus conidia dağılımını gösterdik8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm organ 3D görüntüleme, patojenin organizmadaki anatomik dağılımının mekansal yönlerini araştırmak için büyük önem taşıyan numunenin diseksiyonu olmadan verilerin eldeine izin veriyor. Lazer ışık saçılımının üstesinden gelmeye yardımcı olan ve tüm organ görüntülemeye izin veren doku optik temizlemenin çeşitli teknikleri ve modifikasyonları vardır15,16,18,19</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Aspergillus fumigatus conidia strain AfS150’yi sağladığı için Prof. Sven Krappmann’a (Erlangen Üniversite Hastanesi ve FUA Erlangen-Nürnberg, Almanya) teşekkür ediyor. Yazarlar MIPT Basın Bürosu’na teşekkür eder. V.B. Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı’nı kabul eder (#075-00337-20-03, FSMG-2020-0003 projesi). A. fumigatus conidia görüntüleme ve niceleme ile ilgili çalışma RSF No 19-75-00082 tarafından desteklendi. Hava yolu görüntüleme ile ilgili çalışma RFBR No 20-04-60311 tarafından desteklendi.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Referências
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
