Confocal الليزر المسح المجهري القائم على التحليل الكمي من Aspergillus fumigatus كونيديا التوزيع في كامل جبل تطهيرها بصريا الرئة الماوس
Summary
نحن نصف طريقة التحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس فوميديا (3 ميكرومتر في الحجم) في الشعب الهوائية للفئران. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل الجسيمات الدقيقة وتوزيع الجسيمات النانوية في الشعب الهوائية في مختلف نماذج الحالة المرضية.
Abstract
أسبرجريلوس فوميديا هي مسببات الأمراض المحمولة جوا التي يمكن أن تخترق الشعب الهوائية البشرية. الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة دون حساسية يظهرون مقاومة وتسامحا مناعيا ، بينما في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة ، يمكن أن تستعمر كونيديا الشعب الهوائية وتسبب اضطرابات تنفسية غازية شديدة. وتشارك خلايا مختلفة في مقصورات مجرى الهواء المختلفة في الاستجابة المناعية التي تمنع الغزو الفطري. ومع ذلك ، فإن الجوانب الزمنية للتخلص من مسببات الأمراض لا تزال غير مفهومة تماما. يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للأعضاء الكاملة التركيب التي تم تطهيرها بصريا ، وخاصة رئتي الفئران التجريبية ، بالكشف عن مسببات الأمراض المسماة بالفلورسنت في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. في هذه الدراسة، ونحن نصف الإعداد التجريبي لإجراء تحليل كمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM)، تتبعنا موقع كونيديا المسمى الفلورسنت في فروع الشعب الهوائية ومقصورة الحويصلات الهوائية 6 ساعات بعد تطبيق البلعوم الأوروفاري إلى الفئران. وقد استخدم النهج الموصوف هنا في السابق للكشف عن موقع مسببات الأمراض الدقيق وتحديد الخلايا المتفاعلة مع مسببات الأمراض في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لتقدير حركية القضاء على مسببات الأمراض في حالات مرضية مختلفة.
Introduction
على أساس يومي ، يستنشق الناس مسببات الأمراض المحمولة جوا ، بما في ذلك جراثيم الفطريات الانتهازية Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) التي يمكن أن تخترق الجهاز التنفسي1. الجهاز التنفسي للثدييات هو نظام من الخطوط الجوية من مختلف الأجيال التي تتميز بهياكل مختلفة من جدران مجرى الهواء2،3،4. تتكون جدران القصبة الهوائية من عدة أنواع من الخلايا من بينها خلايا ciliated التي توفر إزالة المخاطية5. في الحويصلات الهوائية ، لا توجد خلايا ciliated ولا يمكن القضاء على مسببات الأمراض الفضائية السنفية المخترقة عن طريق إزالة المخ والخلايا6. وعلاوة على ذلك، كل جيل مجرى الهواء هو مكانة لتجمعات متعددة من الخلايا المناعية ومجموعات فرعية من هذه المجموعات السكانية هي فريدة من نوعها لبعض مقصورات مجرى الهواء. وهكذا، الضامة الحويصلات الموجودة في مقصورات السنف، في حين تصطف كل من القصبة الهوائية والممرات الهوائية موصل مع الخلايا التغصنية داخل الظهارة7،8.
الحجم التقريبي لل A. fumigatus كونيديا هو 2-3.5 ميكرومتر9. وبما أن قطر الشعب الهوائية الصغيرة في البشر وحتى في الفئران يتجاوز 3.5 ميكرومتر ، فقد اقترح أن كونيديا يمكن أن تخترق الفضاء الحويصلات2،10،11. في الواقع ، أظهر الفحص النسيجي النمو الفطري في الحويصلات الهوائية للمرضى الذين يعانون من داء الرشاشيات12. كما تم الكشف عن كونيديا في الحويصلات الهوائية من الفئران المصابة باستخدام التصوير الحي لشرائح الرئة سميكة13. في وقت واحد ، تم الكشف عن كونيديا في الجانب الإنارة من ظهارة الشعب الهوائية للفئران14.
ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير من مسح بصريا كامل جبل الماوس الرئتين يسمح التحليل المورفومتري للخطوط الجوية15. على وجه الخصوص ، تم إجراء التحليل الكمي لتوزيع العصب الجنبي الحشوي باستخدام عينات الرئة الماوس مسح بصريا15. في الآونة الأخيرة ، حقق Amich وآخرون16 في النمو الفطري بعد تطبيق كونيديا داخل الجهاز الداخلي على الفئران المنقوصة المناعية باستخدام مجهر مضان خفيف الورقة لعينات الرئة الماوس مسحت بصريا. الموقع الدقيق للكونيديا يستريح في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى مهم لتحديد مجموعات الخلايا التي يمكن أن توفر ما يكفي من الدفاع المضاد للفطريات في مراحل معينة من الالتهاب. ومع ذلك ، نظرا للحجم الصغير نسبيا ، فإن الجوانب الزمنية للتبخير A. conidia التوزيع في الشعب الهوائية هي سيئة الخصائص.
هنا، نقدم إعداد تجريبي للتحليل الكمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية للفئران المصابة. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM) من الرئتين تطهيرها بصريا من الفئران التي تلقت تطبيق البلعوم من الفلورسنت المسمى A. fumigatus كونيديا، نحصل على صور 3D وإجراء معالجة الصور. باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد لفص الرئة كامل الجبل ، أظهرنا سابقا توزيع A. fumigatus conidia في مجرى الهواء لإجراء الفئران بعد 72 ساعة من تطبيق كونيديا8.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد لكامل الأعضاء بالحصول على البيانات دون تشريح العينة ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للتحقيق في الجوانب المكانية للتوزيع التشريحي للمسبب الممرض في الكائن الحي. هناك العديد من التقنيات والتعديلات من الأنسجة البصرية المقاصة التي تساعد على التغلب على ضوء الليزر التشتت و?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون البروفيسور سفين كرابمان (المستشفى الجامعي إرلانغن وFUA Erlangen-Nürnberg، ألمانيا) على توفير سلالة أسبرجيلوس فوميديا AfS150. يشكر المؤلفون المكتب الصحفي ل MIPT. V.B تعترف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (#075-00337-20-03، مشروع FSMG-2020-0003). تم دعم العمل المتعلق بالتصوير والتحديد الكمي ل A. fumigatus conidia من قبل RSF No 19-75-00082. تم دعم العمل المتعلق بتصوير الخطوط الجوية من قبل RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Referências
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
