Summary

穆林·德克斯特兰硫酸钠诱导结肠炎模型中肠道炎症的系统评分分析

Published: February 14, 2021
doi:

Summary

使用免费计算机辅助系统系统地对肠道炎症进行评分,是定量比较以溃疡和炎症变化为特征的结肠炎模型组织病理变化的有力工具。病理结肠炎评分评估加强临床观察,便于数据解释。

Abstract

Murine结肠炎模型是广泛应用于研究的工具,专注于了解炎症性肠道疾病的病理生物学。然而,对疾病严重程度进行客观和可重复量化的有力标准仍有待确定。大多数结肠炎分析方法依赖于对小段肠道的有限组织学评分,导致部分或偏置分析。在这里,我们结合了高分辨率图像采集和纵向分析整个结肠,以量化肠道损伤和溃疡在脱硫酸钠(DSS)诱导模型的穆林结肠炎。此协议允许在没有广泛的用户培训的情况下生成客观和可重复的结果。在这里,我们使用DSS诱导结肠炎的数据示例提供样品制备和图像分析的全面详细信息。这种方法可以很容易地适应其他模式的穆林结肠炎,有与粘膜损伤相关的重大炎症。我们证明,与结肠的完整长度相比,发炎/受伤和侵蚀/溃疡粘膜的分数与临床发现(如DSS引起的疾病进展中的体重减轻)密切相关。该组织学协议为DSS结肠炎实验中公正地标准化疾病活动分析提供了可靠的时间和具有成本效益的帮助。

Introduction

胃肠道上皮屏障在将发光抗原和病原与底层组织隔间1分离方面起着举足轻重的作用。在炎症性肠病 (IBD)、 缺血或手术损伤等病理条件下看到的上皮损伤和粘膜损伤与临床症状相关,这些症状包括腹泻、体重减轻、大便中的血液和腹痛。作为对损伤的反应,上皮细胞迁移和增殖,以重新上皮化和修复粘膜屏障缺陷。解决炎症和恢复粘性完整性是重建肠道粘胶平衡和功能2,3,4的关键。

各种动物模型被用来研究与肠道上皮屏障损伤相关的基本分子机制。化学诱发结肠炎的成熟和易于应用的模型被广泛使用,特别是在与炎症损伤相关的研究(如IBD)中。一种常见的、可重复的和可靠的粘膜结肠炎模型采用脱硫酸钠(DSS)调解结肠损伤和炎症。疾病的严重程度因小鼠菌株、DSS剂量、DSS给药时间长短和DSS5、6、7的分子量而异。

DSS结肠炎期间的肠道粘膜损伤通常使用疾病活动指数(DAI)进行评估,该指数是由体重减轻、粪便血液含量和粪便一致性决定的综合评分。粪便血液含量可以是微观的(使用粪便瓜亚酸测试检测)或宏观的:粪便一致性分为硬、软或液体(即腹泻)5,8。这些临床参数的评分可能是主观的,可能因用户的经验和偏差而异,尽管总体而言,这些数据提供了可靠的信息,因此IBD研究人员广泛使用。相比之下,没有普遍接受的粘膜损伤的病理学评估方法。最常见的情况是,结肠的选定区域由训练有素的病理学家检查,并根据几个参数进行评分,这些参数通常包括隐性损伤和白细胞渗透9、10、11。但是,由于被调查参数的数量和分析的组织数量在单个报告之间差异很大,因此许多已发表的研究的可比性有限。为了减少观察者偏见和增强相互学习的和谐,理想的组织学评分协议应:1) 包括结肠的整个长度,因为肠道粘膜炎症通常是可变的,跳过病变是常见的,2) 将分析限制在特定的关键和易于解释的参数,以降低主观性: 3) 促进快速、一致地处理大量样本;4) 使用广泛可用且负担得起的工具进行数据采集、分析和演示。

在这里,我们描述了一种技术,以”瑞士卷”配置处理小肠的整个结肠或长段,以及使用免费的计算机辅助评分系统来分析肠道粘膜炎症和损伤,因为DSS引起的结肠炎。

Protocol

所有描述的动物实验都得到了密歇根大学动物使用和护理委员会的批准。 1. 组织收获 根据批准的协议,使用异氟烷麻醉进行人道安乐死小鼠,然后进行宫颈错位。对于所有动物实验,经认证的审查委员会根据国家和机构动物处理准则获得批准。 将鼠标放在解剖垫上,处于超平位置。使用 20 G x 1 1/2 英寸 G 针固定鼠标四肢。 使用钳子和剪刀,在腹部皮肤…

Representative Results

为了说明这种组虫结肠炎评分分析在DSS挑战和随后从结肠炎中恢复的粘膜损伤背景下的可靠性,我们在8只10周大的雄性C57BL6野生型小鼠的饮用水中施用了2.5%的DSS,为期5天,然后是常规水的恢复期为5天。在DSS的急性给用期间,体重没有变化,从第0天到第5天(图4A)。第5天之后,当老鼠开始喝普通的自来水时,体重急剧下降。血液和软凳子出现后,3?…

Discussion

我们的组织结肠炎评分系统是量化肠道组织炎症和损伤的可靠工具。这种方法提高了对整个器官组织病理状态的理解,而没有选择小区域或不完整部分的偏见。成功执行此协议的关键步骤之一是适当准备瑞士卷,以便分析至少 90% 的结肠长度:石蜡嵌入和切口期间平行方向,以确保具有上皮墓穴纵向视图的直线和均匀组织部分:在经验丰富的病理学家的监督下进行实践和培训,以确认受训人员识?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者希望感谢NIH资助DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564和密歇根大学病理学幻灯片扫描服务的支持。

Materials

Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning Leica Biosystems Aperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier VWR International 56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg GT Midwest TL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher scientific 14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 11103-09
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 14084-09
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea Fisherbran 70% denatured ethyl alcohol
ImageScope Aperio Version 12.3.3.5039 http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: Sterile Starplex Scientific B120210
Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium Corning 21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm Instech FTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305109
Syringe, 10 ml BD (Becton, Dickinson and Company) 302995
Unisette Tissue Cassettes Simport M505-2

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Citar este artigo
Garcia-Hernandez, V., Neumann, P., Koch, S., Lyons, R., Nusrat, A., Parkos, C. A. Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model. J. Vis. Exp. (168), e62135, doi:10.3791/62135 (2021).

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