Систематический анализ скоринга для воспаления кишечника в Murine Dextran Сульфат-индуцированных Колит модели
Summary
Систематический скоринг воспаления кишечника с помощью бесплатной компьютерной системы является мощным инструментом для количественного сравнения гистопатологических изменений в моделях колита, характеризующихся наличием язв и воспалительных изменений. Оценка гистологического колита усиливает клинические наблюдения и облегчает интерпретацию данных.
Abstract
Модели мурин-колита являются инструментами, которые широко используются в исследованиях, ориентированных на понимание патобиологии воспалительных кишечных расстройств. Однако еще не определены надежные стандарты объективной и воспроизводимой количественной оценки тяжести заболевания. Большинство методов анализа колита полагаются на ограниченный гистологический скоринг небольших сегментов кишечника, что приводит к частичному или предвзятому анализу. Здесь мы объединяем получение изображений с высоким разрешением и продольный анализ всей толстой кишки для количественной оценки кишечных повреждений и язв в декстране сульфата натрия (DSS) индуцированной модели мурин-колита. Этот протокол позволяет получать объективные и воспроизводимые результаты без тщательного обучения пользователей. Здесь мы предоставляем исчерпывающую информацию о подготовке образца и анализе изображений на примерах данных из индуцированного Колита DSS. Этот метод может быть легко адаптирован к другим моделям мурин-колита, которые имеют значительное воспаление, связанное с слизистой травмы. Мы демонстрируем, что доля воспаленных / раненых и эрозии / язвенной слизистой оболочки по отношению к полной длине толстой кишки тесно параллели клинических выводов, таких как потеря веса среди DSS-индуцированной прогрессии заболевания. Этот гистологический протокол обеспечивает надежное время и экономически эффективную помощь для стандартизации анализа активности болезни в беспристрастной манере в экспериментах DSS колита.
Introduction
Эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта играет ключевую роль в отделении светящихся антигенов и патогенных микроорганизмов от основных отсековтканей 1. Эпителиальная травма и слизистые раны, замеченные в патологических состояниях, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD), ишемия, или хирургические травмы связаны с клиническими симптомами, которые включают диарею, потеря веса, кровь в стуле, и боли в животе. В ответ на травмы эпителиальные клетки мигрируют и размножаются для повторной эпителиализы и ремонта дефектов слизистой оболочки. Разрешение воспаления и восстановление слизистой целостности имеют решающее значение для восстановления кишечного слизистого гомеостазаи функции 2,3,4.
Различные модели животных были использованы для изучения основных молекулярных механизмов, которые связаны с повреждением кишечного эпителиального барьера. Широко используются хорошо известные и легко применимые модели химически индуцированного колита, особенно в исследованиях, связанных с воспалительными травмами, такими как IBD. Общие, воспроизводимые, и надежные модели мурин колит использует декстран сульфат натрия (DSS) опосредовано травмы толстой кишки и воспаление. Тяжесть заболевания варьируется в зависимости от штамма мыши, дозы DSS, длины Введения DSS, и молекулярного веса DSS5,6,7.
Повреждение слизистой оболочки кишечника во время DSS колита, как правило, оценивается с помощью индекса активности болезни (DAI), композитный балл определяется потеря веса, содержание фекальной крови, и консистенции стула. Содержание фекальной крови может быть микроскопическим (обнаружено с помощью теста на гуюаку стула) или макроскопическим; фекальная консистенция классифицируется как твердый, мягкий или жидкий (т.е.диарея) 5,8. Оценка этих клинических параметров может быть субъективной и может варьироваться в зависимости от опыта пользователя и предвзятости, хотя в целом, данные предоставляют достоверную информацию и, таким образом, широко используются исследователями IBD. В отличие от этого, не существует общепринятого метода гистологической оценки слизистой оболочки. Чаще всего, выбранные участки толстой кишки проверяются обученным патологоанатомом и забил на основе нескольких параметров, которые обычно включают травмы склепа и проникновениялейкоцитов 9,10,11. Однако, поскольку количество исследованных параметров и количество анализируемой ткани значительно варьируется между отдельными отчетами, сопоставимость многих опубликованных исследований ограничена. Чтобы уменьшить предвзятость наблюдателя и повысить межобученную согласие, идеальный гистологический протокол скоринга должен: 1) включать всю длину толстой кишки, так как воспаление слизистой оболочки кишечника чаще всего является переменным и пропускать поражения являются общими, 2) ограничить анализ конкретных ключевых и легко интерпретируемых параметров для снижения субъективности, 3) облегчить быструю, последовательную обработку большого количества образцов, и 4) использовать широко доступные и доступные инструменты для получения данных.
Здесь мы описываем технику обработки всей толстой кишки или длинные сегменты тонкой кишки в “швейцарский рулон” конфигурации наряду с использованием бесплатной компьютерной системы скоринга для анализа кишечных слизистых воспалений и повреждений из-за DSS-индуцированного колита.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наша гистологическая система оценки колита представляет собой надежный инструмент для количественной оценки воспаления тканей и повреждений кишечника. Такой подход обеспечивает лучшее понимание гистопатологического состояния всего органа без смещения выбора небольших участков ил…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NIH финансирования DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 и Мичиганского университета патологии слайд сканирования услуг.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
Referências
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
