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Bioquímica

फैटी Acylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए Alkynyl फैटी एसिड Analogs के अनुकूलित निगमन क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

फैटी एसाइलेशन के अध्ययन में सेलुलर प्रोटीन इंटरैक्शन और बीमारियों में महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। यहां प्रस्तुत एक संशोधित प्रोटोकॉल फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने में सुधार करने के लिए है, जिसे विभिन्न सेल प्रकारों में लागू किया जा सकता है और पल्स-चेस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सहित अन्य assays के साथ संयुक्त किया जा सकता है।

Abstract

फैटी एसाइलेशन, प्रोटीन सब्सट्रेट के लिए संतृप्त फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़, कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में इसके निहितार्थ के अलावा सेलुलर कार्यों के असंख्य को विनियमित करने में महत्वपूर्ण है। फैटी एसाइलेशन डिटेक्शन विधियों में हाल के विकास ने फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन के कुशल और गैर-खतरनाक पता लगाने को सक्षम किया है, विशेष रूप से जैव-ऑर्थोगोनल लेबलिंग के साथ क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग के माध्यम से। हालांकि, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने को सेल संस्कृति में लंबी श्रृंखला फैटी एसिड जोड़ने के खराब घुलनशीलता और संभावित विषाक्त प्रभावों द्वारा सीमित किया जा सकता है। यहां वर्णित फैटी-एसिड मुक्त बीएसए के साथ संयोजन में सैपोनिफाइड फैटी एसिड का उपयोग करके अनुकूलित वितरण के साथ एक लेबलिंग दृष्टिकोण है, साथ ही साथ डिलिपिडेड मीडिया भी है, जो फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए कठिन का पता लगाने में सुधार कर सकता है। यह प्रभाव एल्काइनिल-स्टीयरेट एनालॉग, 17-ODYA के साथ सबसे अधिक स्पष्ट था, जो एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला फैटी एसिड एनालॉग रहा है। यह संशोधन सेलुलर निगमन में सुधार करेगा और एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि करेगा। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में लागू किया जा सकता है और अन्य assays जैसे पल्स-चेस विश्लेषण, सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग, और फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन की मात्रात्मक प्रोफाइलिंग के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त किया जा सकता है।

Introduction

फैटी एसाइलेशन में प्रोटीन के लिए फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़ शामिल हैं और प्रोटीन-झिल्ली इंटरैक्शन को बढ़ावा देने में इसके महत्व के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, लेकिन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचनात्मक परिवर्तनों को बढ़ावा देने और एंजाइमों के उत्प्रेरक साइटों को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है1,2,3,4,5,6,7 . फैटी एसाइलेशन संक्रमण, कैंसर, सूजन और न्यूरोडीजेनेरेशन सहित असंख्य बीमारियों में एक संभावित दवा लक्ष्य के रूप में उभरा है, जहां पामिटोइलेशन में व्यवधानों को 8,9,10,11,12,13 प्रलेखित किया गया है। यह मुख्य रूप से नए रासायनिक पहचान विधियों के विकास से प्रेरित है, जिसने एस-एसाइलेटेड प्रोटीन लक्ष्यों की बड़े पैमाने पर पहचान को सक्षम किया।

फैटी एसाइलेशन में संतृप्त और असंतृप्त फैटी एसिड के सहसंयोजक जोड़ को शामिल करने वाले विभिन्न संशोधन शामिल हो सकते हैं, लेकिन आमतौर पर एन-मायरिस्टोलेशन और एस-एसाइलेशन को संदर्भित करता है। एन-मायरिस्टोलेशन एन-टर्मिनल ग्लाइसिन में मायरिस्टिक एसिड के अलावा को संदर्भित करता है या तो नवजात पॉलीपेप्टाइड्स पर सह-अनुवाद रूप से या प्रोटियोलिटिक दरार 2,14 के बाद नए उजागर एन-टर्मिनल ग्लाइसिन पर पोस्ट-ट्रांसलेशनली। एन-myristoylation एक अपरिवर्तनीय एमाइड बंधन के माध्यम से होता है। दूसरी ओर, एस-एसिलेशन आमतौर पर एक थायोएस्टर बॉन्ड के माध्यम से सिस्टीन अवशेषों के लिए लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के प्रतिवर्ती जोड़ को संदर्भित करता है। इस संशोधन के सबसे आम रूप में पाल्मिटेट का समावेश शामिल है और इसलिए, आमतौर पर एस-पाल्मिटोइलेशन के रूप में जाना जाता है, या बस पाल्मिटोइलेशन 11,15। कई मायनों में, एस-पामिटोइलेशन फॉस्फोराइलेशन के समान है। यह गतिशील, एंजाइमेटिक रूप से विनियमित है, और अत्यधिक असभ्य साबित हो रहा है।

पिछले दशक तक, फैटी एसाइलेशन का अध्ययन सीमित पहचान विधियों द्वारा बाधित किया गया था, जिसके लिए रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए फैटी एसिड की आवश्यकता थी। इसके कई नुकसान थे, जिनमें लागत, सुरक्षा के मुद्दे और बहुत लंबे समय तक पता लगाने का समय शामिल था। आमतौर पर, S-acylation16 का पता लगाने के लिए या तो tritiated या iodinated palmitate का उपयोग किया गया था। Tritiated palmitate autoradiography फिल्म है, जो हफ्तों से महीनों तक ले जा सकते हैं के साथ लंबी पहचान अवधि की आवश्यकता है. जबकि [125I] आयोडो-फैटी एसिड एनालॉग्स ने पहचान के समय को कम कर दिया, इसने बहुत अधिक सुरक्षा जोखिम प्रस्तुत किया और प्रयोगकर्ताओं की करीबी थायराइड निगरानी की आवश्यकता थी। इसके अलावा, ये विधियां गैर-मात्रात्मक थीं, इसलिए, गतिशील पामिटोइलेशन को मापने की क्षमता को सीमित करती हैं, और अतिरिक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और रेडियोधर्मी निगरानी के कारण सेट-अप और सफाई के लिए समय लेती हैं। अंत में, रेडियोधर्मी लेबल प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं थे और आमतौर पर ब्याज के विशिष्ट प्रोटीन के कम थ्रूपुट का पता लगाने तक सीमित थे। जैसा कि अधिक सब्सट्रेट का पता लगाया गया था और, अनिवार्य रूप से प्रत्येक संशोधन की मध्यस्थता करने वाले एंजाइमों की पहचान की गई थी, यह स्पष्ट था कि नए पहचान विधियों की आवश्यकता थी17,18,19,20,21। लगभग एक साथ, फैटी एसिलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए कई नए तरीके उत्पन्न हुए। पहला एस-एसाइलेशन के थायोएस्टर बॉन्ड की उत्क्रमण और प्रतिक्रियाशीलता का शोषण करता है। एसाइल-बायोटिन एक्सचेंज (एबीई) परख रासायनिक रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन के बाद के पुलडाउन के लिए बायोटिन के साथ पाल्मिटेट को प्रतिस्थापित करता है, जो एविडिन एगारोज़ मोतियों का उपयोग करता है और पश्चिमी धब्बा 22,23,24 द्वारा प्रत्यक्ष पता लगाता है। इसके बाद, फैटी एसिड के जैव-ओर्थोगोनल लेबलिंग और टैग या हैंडल के लिए chemoselective इसके अलावा विकसित किए गए थे जिसमें स्टॉडिंगर बंधाव का उपयोग शामिल था और रसायन विज्ञान 25,26,27,28,29,30,31,32,33 पर क्लिक करें . अंत में, एबीई के समान, एसाइल-राल असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) अनिवार्य रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 34,35 को कैप्चर करने और पता लगाने के लिए थिओल-प्रतिक्रियाशील मोतियों के साथ एस-एसाइलेटेड साइटों को बदल देता है। साथ में, विनिमय और क्लिक-रसायन विज्ञान-आधारित assays ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एसाइलेशन का पता लगाने और आत्मीयता शुद्धिकरण के अधिक कुशल और संवेदनशील तरीके प्रदान किए हैं और बाद में हजारों एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 8,36 की खोज के लिए नेतृत्व किया है।

क्लिक रसायन विज्ञान शब्द में रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक समूह शामिल है, लेकिन आमतौर पर Cu (I) को संदर्भित करता है – उत्प्रेरित azido-alkyne [3 + 2] एक एल्काइनिल समूह और एक azido समूह 27,28,37 के बीच cycloaddition प्रतिक्रिया तंत्र। विशेष रूप से, फैटी एसाइलेशन के मामले में, क्लिक रसायन विज्ञान में जैव-ओर्थोगोनल 16-कार्बन एल्काइनिल-पाल्मिटेट (15-हेक्साडेसिनोइक एसिड; 15-एचडीवाईए) या 14-कार्बन एल्काइनिल-मायरिस्टेट (13-टेट्राडेसिनोइक एसिड; 13-टीडीवाईए) को शामिल करके क्रमशः एस-पाल्मिटोइलेशन या एन-मायरिस्टिलेशन का पता लगाना शामिल है, जो अंतर्जात रूप से एसाइलेटेड प्रोटीन को लेबल करने के लिए कोशिकाओं में शामिल है28 . सेल lysis और ब्याज के प्रोटीन के immunoprecipitation के बाद, एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया (एक alkyne और एक azide के बीच सहसंयोजक लिंकेज) एक आत्मीयता जांच, आमतौर पर biotin, पश्चिमी धब्बा 28,37 द्वारा पता लगाने के लिए बांधने के लिए किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, क्लिक रसायन विज्ञान कुल सेल lysate पर प्रदर्शन किया जा सकता है और फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान के लिए आत्मीयता शुद्ध किया जा सकता है। Azido-biotin के साथ प्रारंभिक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया रेडियोधर्मिता 2 की तुलना में एक लाख से अधिक बार पता लगाने की चयनात्मकता और संवेदनशीलता में वृद्धि हुई। क्लिक रसायन विज्ञान का एक और लाभ यह है कि इसे अन्य शास्त्रीय लेबलिंग विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि मात्रात्मक विश्लेषण 38 के लिए एज़िडो-होमोएलनिन का उपयोग करके प्रोटीन टर्नओवर का पल्स-चेस विश्लेषण। इसके अलावा, प्रोटीन स्थानीयकरण 16,28,39 की जांच करने के लिए बायोटिन या अन्य जैव रासायनिक जांच, जैसे कि फ्लैग या माइक टैग के बजाय फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग किया जा सकता है।

क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग की सापेक्ष आसानी के बावजूद, सेल कल्चर 40 में लंबी श्रृंखला मुक्त फैटी एसिड का उपयोग करने की कम घुलनशीलता और संभावित विषाक्तता द्वारा पहचान को सीमित किया जा सकता है। विशेष रूप से, अधिकांश प्रोटीन के लिए एस-एसाइलेशन के दौरान पामिटेट की वरीयता के बावजूद, कई अध्ययनों ने अपनी वाणिज्यिक उपलब्धता और अपेक्षाकृत कम लागत के कारण एस-एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने के लिए पामिटेट (15-एचडीवाईए) के बजाय 18-कार्बन स्टीरेट (17-ऑक्टाडेसिनोइक एसिड – 17-ओडीवाईए) का उपयोग किया है। हालांकि, 17-ODYA बहुत अघुलनशील है और उपयोग किए जाने पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, क्लिक करें रसायन विज्ञान कुछ सूक्ष्म तैयारी और रसायनों के भंडारण की आवश्यकता हो सकती है। इसमें, प्रोटोकॉल एक लेबलिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है, जो फैटी एसिड के सैपोनिफिकेशन का उपयोग करके डिलीवरी को अनुकूलित करता है, फैटी-एसिड मुक्त बीएसए के साथ प्रसव, और घुलनशीलता बढ़ाने और कोशिकाओं में मुक्त फैटी एसिड जोड़ने के संभावित विषाक्त प्रभावों को बाईपास करने के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को डिलिपिडेट किया जाता है। यह विधि विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में काम करती है और यहां तक कि जीवित जानवरों में भी उपयोग की गई है28।

Protocol

1. सेल संस्कृति सेल संस्कृति के लिए DMEM (Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम) के पूरक के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 mM L-glutamine, और 100 mM सोडियम पाइरूवेट (1% vol / vol) जोड़ें। प्लेट लगभग 5 x 105 HEK293T कोशिकाओं / एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति पकवान के अच्छी तरह से और 5% CO2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में 18 घंटे के लिए बढ़ने के लिए 75% -80% confluency तक पहुँचने के लिए। फैटी एसिड सीरम अभाव लेबलिंग मीडिया तैयार करने के लिए, 10% FBS के बिना ऊपर (चरण 1.1) के रूप में DMEM तैयार करें। FBS को 5% dextran-charcoal coated FBS (DCC-FBS) के साथ बदलें। उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। धीरे से कमरे के तापमान पर 1x फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के साथ कोशिकाओं को धोलें और लेबलिंग मीडिया के साथ बदलें।नोट: HEK293T कोशिकाएं ऊतक संस्कृति प्लेटों से आसानी से अलग हो जाती हैं। कोशिकाओं को धोने और मीडिया की जगह लेते समय ध्यान रखें। जितना संभव हो सके इनक्यूबेटर से और उससे स्थानांतरण के दौरान आंदोलन को कम से कम करें। कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C इनक्यूबेटर पर वापस लाएं और फैटी एसिड के साथ चयापचय लेबलिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले लगभग 45 मिनट (न्यूनतम 15 मिनट प्रभावी है), 60 मिनट तक इनक्यूबेट करें। 2. तैयारी और फैटी एसिड analogs के saponification निम्नलिखित सांद्रता प्राप्त करने और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए डीएमएसओ में घुलनशीलता द्वारा समय से पहले एल्काइनिल फैटी एसिड के स्टॉक समाधान तैयार करें। आवश्यकतानुसार कमरे के तापमान पर पिघलना। N2 या Ar के तहत अपने सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए तैयारियों को स्टोर करें।Alkynyl-myristate (13-tetradecynoic एसिड, 13-TDYA): 25 mMAlkynyl-palmitate (15-हेक्साडेसिनोइक एसिड; 15-HDYA): 100 mMAlkynyl-stearate (17-octadecynoic एसिड; 17-ODYA): 100 mM 20% फैटी एसिड मुक्त बीएसए (एफएएफबीएसए) तैयार करने के लिए, 50 एमएल डिस्पोजेबल ट्यूब में 2 ग्राम एफएएफबीएसए का वजन करें। पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) डीएमईएम के साथ 10 मिलीलीटर तक लाएं। एंड-ओवर-एंड रोटेशन द्वारा या भंवर द्वारा मिश्रण करें, और FAFBSA को पूरी तरह से भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें। माध्यम को निष्फल करने के लिए 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करें। लगभग 1 मिलीलीटर वॉल्यूम में एलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले पानी के स्नान में आवश्यकतानुसार और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म हो जाना। फैटी एसिड और फैटी एसिड एनालॉग्स की घुलनशीलता को बढ़ाने के लिए, 3 एमएल ग्लास शंक्वाकार प्रतिक्रिया शीशियों में पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (KOH) के 20% दाढ़ अतिरिक्त के साथ incubating द्वारा saponify।नोट: ये शीशियां नमक को घुलनशील रहने की अनुमति देती हैं, जबकि यह सुनिश्चित करती हैं कि FAFBSA उच्च गर्मी से इकट्ठा नहीं होता है। कांच का उपयोग फैटी एसिड को प्लास्टिक से चिपकने से भी रोकता है। पिपेट कम से कम 2 μL alkynyl फैटी एसिड एनालॉग के सीधे एक 3 एमएल शंक्वाकार प्रतिक्रिया शीशी के नीचे करने के लिए बाहर. एक 6-अच्छी तरह से इस्तेमाल की गई प्लेट के प्रति अच्छी तरह से लिपिड के 2 μL तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।नोट: फैटी एसिड की हाइड्रोफोबिकिटी के कारण, प्रतिक्रिया शीशी में वितरित करने से पहले वांछित मात्रा को कई बार खींचकर पिपेट की नोक को कोट करना सबसे अच्छा है। एल्काइनिल फैटी एसिड लेबल के 20% दाढ़ की अधिकता के बराबर सांद्रता के लिए 1 एम कोह को पतला करें (13-TDYA के लिए 30 mM और 15-HDYA और 17-ODYA के लिए 120 mM)। पिपेट ने पतले KOH (1 μL: 1 μL फैटी एसिड: KOH) की एक समान मात्रा को कांच के किनारे पर प्रतिक्रिया शीशी के नीचे के करीब रखा है, जैसे कि KOH की वितरित मात्रा फैटी एसिड के साथ मिश्रण करती है। शीशी के ढक्कन को बंद करें और समाधानों को मिलाने के लिए धीरे से टैप करें।नोट: मिश्रण जल्दी से ठोस हो सकता है, खासकर फैटी एसिड की हाइड्रोकार्बन श्रृंखला की बढ़ती लंबाई के साथ। सावधान रहें कि ठोस को पिपेट न करें (यानी, पिपेटिंग द्वारा मिश्रण न करें)। लगभग 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया शीशी को गर्म करें, या जैसे ही फैटी एसिड को शामिल किया जाता है (समाधान स्पष्ट हो जाता है)।नोट: कार्बन की एक उच्च संख्या के साथ फैटी एसिड और घुलनशीलता में कमी, जैसे कि stearate (17-ODYA), 65 डिग्री सेल्सियस पर KOH में पूरी तरह से शामिल होने के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार की आवश्यकता हो सकती है। यदि आवश्यक हो तो तापमान को 70 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं। एक पानी स्नान सबसे अच्छा है। ध्यान रखें कि तरल बहुत अधिक वाष्पित न हो। एक बार जब फैटी एसिड समाधान में चले गए हैं और कोई दृश्यमान ठोस नहीं रहता है, तो पिपेट ने 20% एफएएफबीएसए को इस तरह से तैयार किया कि फैटी एसिड की मात्रा अनुपात: KOH: FAFBSA 1: 1: 50 है 20x BSA-बाउंड एल्काइनिल फैटी एसिड की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. समाधान आमतौर पर कोई दिखाई देने वाले ठोस के साथ स्पष्ट दिखाई देता है।नोट: आमतौर पर, कोई भी छोटा ठोस 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद समाधान में जाएगा। फैटी एसिड और FAFBSA को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।नोट:: इस बिंदु पर saponified लेबल 15 मिनट से परे स्थिर है।   कुल मीडिया वॉल्यूम (mL) Vol. फैटी एसिड या फैटी एसिड एनालॉग (μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) BSA-संयुग्मित saponified लेबल (μL) का कुल खंड 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 तालिका 1: Saponified फैटी एसिड लेबलिंग अनुपात. फैटी एसिड, KOH, और FAFBSA के प्रयोगात्मक संस्करणों का उपयोग किया मीडिया की मात्रा के अनुसार फैटी एसिड लेबल के saponification के लिए. एक नियंत्रण के रूप में, चरण 2.3 दोहराएँ। एक alkyne लेबल के बिना फैटी एसिड के साथ. 20x फैटी एसिड-बीएसए संयुग्मन की 1/20 मात्रा के साथ कोशिकाओं को सीधे भुखमरी मीडिया (आमतौर पर, 2 एमएल मीडिया / कोशिकाओं में 100 μL) पर लेबल करें ताकि अल्काइनाइल-माइरिस्टेट के लिए 1% बीएसए और 25 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जा सके, या अल्काइनाइल-पाल्मिटेट और अल्काइनाइल-स्टीरेट के लिए 100 μM।नोट: संलग्न कोशिकाओं के लिए भौतिक गड़बड़ी की मात्रा को कम करने के लिए, मीडिया में सीधे pipetting के बजाय मीडिया की सतह के करीब पिपेट की नोक पर एक बूंद बनाएँ। यदि एसाइलेशन इनहिबिटर का उपयोग कर रहे हैं, तो लेबल किए गए फैटी एसिड से कम से कम 15 मिनट पहले जोड़ें। उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं या अवरोधक के आधार पर समय अलग-अलग हो सकता है। यह इस कदम के रूप में अच्छी तरह से 28 के लिए saponification का उपयोग करने के लिए सिफारिश की गई है। तुलना के लिए, बिना लेबल वाले फैटी एसिड के 2 μL (या वॉल्यूम सैपोनिफाइड के बराबर) को सीधे भुखमरी मीडिया में पिपेट करके गैर-सैपोनिफाइड लिपिड जोड़ें। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 3-6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।नोट:: इष्टतम लेबलिंग समय प्रत्येक कक्ष प्रकार या प्रयोगात्मक स्थिति के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। लंबे समय तक इनक्यूबेशन बार संभावित रूप से β-ऑक्सीकरण और / या अन्य लिपिड समूहों में शामिल करके फैटी एसिड के टूटने का कारण बन सकता है, जैसे कि फॉस्फोलिपिड्स 28। धीरे से कमरे के तापमान पर 1x PBS के साथ कोशिकाओं को धोलें। फसल और 500 μL ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ कोशिकाओं को लाइस- मुक्त संशोधित रेडियोइम्यूनोप्रिसिपिटेशन परख (RIPA) बफर (0.1% SDS, 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic एसिड (HEPES) pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% गैर-denaturing डिटर्जेंट, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.5% सोडियम deoxycholate, 2 mM MgCl2 के साथ 2 mM MgCl2 के साथ 1 mM MgCl2 के साथ 1 mM MgCl2 के साथ 1 mM MgCl2 के साथ 1000 μL 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x g पर lysates सेंट्रीफ्यूज। 1.7 mL microcentrifuge ट्यूबों में supernatant ले लीजिए और क्लिक प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -20 °C पर स्टोर करें।नोट:: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। लिसेट 1 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होते हैं। हालांकि, समय पर क्लिक प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक उपयुक्त परख का उपयोग कर प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें, जैसे कि एक डिटर्जेंट संगत (डीसी) परख। 3. सेल lysates पर प्रतिक्रिया पर क्लिक करें क्लिक रसायन विज्ञान के लिए अभिकर्मकों को तैयार करें। DMSO में tris-(benzyltriazolylmethyl) amine (TBTA) को 2 mM तक भंग करें। अप करने के लिए 2-3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर desiccant के साथ छोटे ऐलीकोट में स्टोर। सबसे अच्छा N2 या Ar के तहत संग्रहीत. 50 mM प्राप्त करने के लिए ddH2O पानी में CuSO4 भंग करें। 2 महीने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें। ddH2O पानी में tris-carboxyethylphosphine (TCEP) को 250 mM तक भंग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें और क्लिक प्रतिक्रिया से ठीक पहले ताजा 50 एमएम कमजोर पड़ने दें। DMSO में 2 mM azide तैयार करें। अप करने के लिए 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर desiccant के साथ छोटे ऐलीकोट में स्टोर। सबसे अच्छा N2 या Ar के तहत संग्रहीत.नोट: यह देखा गया कि तीन या अधिक पॉलीथीन ग्लाइकोल समूहों वाले उत्पादों ने बायोटिन के साथ सबसे अच्छा काम किया। ऊपर के रूप में एक ही लाइसिस बफर का उपयोग कर एक ही मात्रा में 1.7 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में प्रोटीन lysates के 50-100 μg लाओ।नोट: प्रतिक्रिया मात्रा को यथासंभव छोटा रखें (20-100 μL)। एक अंतिम 1% एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सोडियम dodecyl सल्फेट (SDS) जोड़ें। क्लिक अभिकर्मकों का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें ताकि लिसेट के अलावा के बाद अंतिम सांद्रता हैं: 100 μM TBTA (2 mM स्टॉक), 1 mM CuSO4, (50 mM स्टॉक) 1 mM TCEP (50 mM स्टॉक), और 100 μM azide probe (2 mM stock)। तदनुसार स्टॉक समाधानों को संयोजित करें ( तालिका 2 देखें)।नोट: आदेश महत्वपूर्ण है। प्रत्येक घटक के अतिरिक्त के बाद पूरी तरह से मिश्रण। lysates में मास्टर मिश्रण के उपयुक्त वॉल्यूम जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अंधेरे में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कभी-कभी उत्तेजित/मिलाना। कुल अभिक्रिया vol (μL) Vol. protein (μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) Vol. TCEP (50 mM) (μL) Vol. azido प्रोब (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 तालिका 2: अभिकर्मक और प्रोटीन वॉल्यूम अनुपात पर क्लिक करें। क्लिक रसायन विज्ञान अभिकर्मकों और इसी स्टॉक सांद्रता के प्रयोगात्मक संस्करणों, प्रोटीन नमूनों की मात्रा के अलावा. 4. immunoprecipitated प्रोटीन पर प्रतिक्रिया पर क्लिक करें वैकल्पिक रूप से, मोतियों पर या बंद immunoprecipitated (आईपी) प्रोटीन पर क्लिक प्रतिक्रिया करना संभव है।नोट: आमतौर पर, मोतियों से क्लिक करने से कम से कम पृष्ठभूमि की ओर जाता है और ब्याज के नए प्रोटीन का परीक्षण करते समय सबसे अच्छा होता है। ब्याज के प्रोटीन के लिए कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें, इस मामले में, वाइल्डटाइप myristoylated सी-टर्मिनल हंटिंगटिन (एचटीटी) जीएफपी (myr-ctHTT-GFP) और एक G2A प्रतिस्थापन के साथ ctHTT-GFP से जुड़ा हुआ है, कैल्शियम फॉस्फेट डीएनए coprecipitation का उपयोग करते हुए, जैसा कि पहले वर्णित 41। प्लेट 2.5 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में और ~ 70-80% confluency के लिए रात भर बढ़ते हैं। 99.75 μL आणविक ग्रेड H2O के साथ 10 μL में 2.5 μg डीएनए जोड़कर एक 1.7 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डीएनए मिश्रण तैयार करें। फिर, डीएनए मिश्रण के लिए 15.25 μL CaCl2 ड्रॉपवाइज जोड़ें। एक अलग ट्यूब में डीएनए / CaCl2 मिश्रण जोड़ें जिसमें 125 μL 2x HEPES बफ़र्ड खारा (HBS, pH 7.0) मिश्रण के साथ एक ड्रॉपवाइज तरीके से होता है। धीरे-धीरे कोशिकाओं में डीएनए / CaCl2 / HBS मिश्रण जोड़ें। 2-4 घंटे के बाद, मीडिया को बदलें और रात भर इनक्यूबेट करें। चरण 1.3-2.8 से लेबलिंग के साथ आगे बढ़ें। लाइसिस बफर में 500 μg प्रोटीन के बराबर मात्रा तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घूर्णन ctHTT-GFP के लिए खरगोश विरोधी GFP के साथ incubating द्वारा आईपी प्रदर्शन। प्रत्येक ट्यूब के लिए लाइसिस बफर के साथ पूर्व-संतुलित 15-20 μL प्रोटीन जी मोतियों को जोड़ें और इसे 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-ओवर-एंड पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। लाइसिस बफर के साथ मोतियों को धोएं और 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES बफर में पुन: निलंबित करें। 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को गर्म करें और ट्यूबों को उलटें या लगभग हर 5 मिनट में आंदोलन करें। संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और 80 डिग्री सेल्सियस पर लौटें। प्रोटीन युक्त supernatant ले लीजिए, जबकि नमूने अभी भी गर्म हैं.नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और immunoprecipitated नमूनों को -20 °C या -80 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि तुरंत क्लिक रसायन विज्ञान के लिए उपयोग नहीं किया जाता है। क्लिक अभिकर्मकों के 7 μL मास्टर मिश्रण के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए supernatant के 43 μL की अनुमति दें। चरण 3.2.3 में वर्णित प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ें। 5. SDS-पेज और पश्चिमी blotting 25 mM dithiothreitol (DTT) और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी युक्त 1x नमूना लोडिंग बफर जोड़कर प्रतिक्रिया और denature बंद करो।नोट: अप करने के लिए 100 mM DTT 28 इस्तेमाल किया जा सकता है. एस-एसाइलेटेड प्रोटीन के साथ β-मर्केप्टोएथेनॉल का उपयोग न करें क्योंकि यह थायोएस्टर बांड को हाइड्रोलाइज़ कर सकता है और क्लिक किए गए फैटी एसिड एनालॉग को हटा सकता है। संक्षेप में नमूनों को नीचे स्पिन करें। एक polyacrylamide जेल पर SDS-पृष्ठ के साथ प्रोटीन अलग, डुप्लिकेट में.नोट: थायोएस्टर बांड की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए KOH के साथ क्षारीय उपचार के लिए दो जैल की आवश्यकता होती है। यदि एक फ्लोरोसेंट एजाइड जांच का उपयोग कर रहे हैं, तो एसाइलेशन को इन-जेल या संकेतित उत्तेजना चैनल का उपयोग करके स्थानांतरण के बाद पता लगाया जा सकता है। polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली के लिए स्थानांतरण (मेथनॉल में सक्रिय और ddH2O में कुल्ला – 5 मिनट प्रत्येक) 25 V, 1.0 A (स्थिर) पर अर्ध-शुष्क हस्तांतरण उपकरण के साथ 30 मिनट के लिए। संक्षेप में ddH2O के साथ झिल्ली को धोने के बाद, मेथनॉल / पानी (9: 1 v / v) में 0.1 M KOH में एक प्रतिकृति झिल्ली को भिगोएं और दूसरा 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 में मेथनॉल / पानी (9: 1 v / v) में एक गैर-क्षारीय नियंत्रण के रूप में कोमल रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए एक गैर-क्षारीय नियंत्रण के रूप में। झिल्ली को संक्षेप में ddH2O पानी में कुल्ला करें, इसके बाद पीबीएस-टी (1x PBS, 0.1% Tween 20) में 5 मिनट धोने का 6 गुना।नोट: अच्छी तरह से धो लें। 5% स्किम दूध अवरुद्ध बफर (1x PBS, 0.1% Tween20) में रात भर झिल्ली को ब्लॉक करें। 6. पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन जहां संकेत दिया गया है, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए स्ट्रेप्टाविडिन (1: 5000) और लोडिंग नियंत्रण, एंटी-जीएपीडीएच रोडामाइन (1: 5000) के साथ जांच 5% बीएसए ब्लॉकिंग बफर (0.01% एसडीएस, 1x पीबीएस, 0.1% ट्वीन 20) में कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट के लिए कोमल रॉकिंग के साथ, अंधेरे में। 5% स्किम दूध अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ पहले इम्यूनोप्रिसिपिटेटेड प्रोटीन ब्लॉट की जांच करें, फिर चरण 6.1 के रूप में 5% बीएसए में उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ। पीबीएस-टी (1x PBS, 0.1% Tween20) में 5 मिनट के लिए झिल्ली को धोएं, कुल चार दोहराता है और इमेजिंग से पहले ddH2O पानी के साथ कुल्ला।

Representative Results

क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए saponified और गैर saponified (गैर sap) alkynyl फैटी एसिड के बीच लेबलिंग दक्षता में अंतर की कल्पना की जा सकती है और पश्चिमी धब्बा के माध्यम से फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन की संकेत तीव्रता द्वारा तुलना की जा सकती है (चित्रा 1)। एसाइल श्रृंखलाओं की बढ़ती लंबाई के साथ एक ध्यान देने योग्य प्रभाव देखा गया था। एल्काइनिल-स्टीयरेट (एल्क-स्टीयर) के साथ लेबल की गई कोशिकाओं में, फैटी एसिड के सैपोनिफिकेशन और चयापचय लेबलिंग के लिए बीएसए के साथ वितरण ने क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन सिग्नल का पता लगाने और फ्लोरोसेंट एज़िडो जांच (चित्रा 1, दाएं) द्वारा पता लगाने में काफी वृद्धि की, जो अल्काइनिल फैटी एसिड लेबल के सेलुलर निगमन में समग्र वृद्धि का सुझाव देता है। इसके विपरीत, सबसे कम और सबसे घुलनशील फैटी एसिड, एल्काइनिल-मायरिस्टेट (अल्क-मायर; 13-टेट्राडेसिनोइक एसिड या 13-टीडीवाईए) के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में कोई ध्यान देने योग्य अंतर नहीं देखा गया था। एल्काइनिल-पाल्मिटेट (चित्रा 1, मध्य) के साथ लेबल की गई कोशिकाओं ने एल्काइनिल-माइरिस्टेट (13-टीडीवाईए) की तुलना में लेबल में एक मध्यवर्ती वृद्धि दिखाई, लेकिन अल्काइनिल-स्टीयरेट से कम। महत्वपूर्ण रूप से, 0.1 M KOH के साथ PVDF झिल्ली के उपचार ने काफी हद तक एल्काइनिल-पाल्मिटेट और एल्काइनिल-स्टीयरेट के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं से फैटी एसिड लेबल को हटा दिया, यह पुष्टि करते हुए कि अधिकांश सिग्नल एक एस्टर या थायोएस्टर बॉन्ड (चित्रा 1, मध्य और दाएं, नीचे पैनलों) के माध्यम से था। जैसा कि अपेक्षित था, अल्काइनिल-मिरिस्टेट का निगमन ज्यादातर क्षार-प्रतिरोधी था (चित्रा 1, बाएं, नीचे पैनल), एक एमाइड बॉन्ड के माध्यम से प्रोटीन के लिए myristate के लगाव के कारण। चित्रा 2 बहुमुखी प्रतिभा और क्लिक रसायन विज्ञान की संवेदनशीलता को दर्शाता है immunoprecipitated प्रोटीन के फैटी acylation का पता लगाने के लिए. HEK293T कोशिकाओं को myristoylated C-terminal huntingtin (HTT) के साथ संक्रमित किया गया था, जो GFP (myr-ctHTT-GFP) से जुड़ा हुआ था और अल्काइनाइल-myristate के साथ लेबल किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था18। immunoprecipitation के बाद, ctHTT-GFP मोतियों से जारी किया गया था और lysates के साथ रसायन विज्ञान पर क्लिक करने के अधीन था। न केवल वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) मायर-सीटीएचटीटी-जीएफपी के मायरिस्टोइलेशन को इम्यूनोप्रिसिपिटेट्स में पाया गया था, बल्कि यह लिसेट में दृढ़ता से पाया गया था, जबकि जी 2 ए उत्परिवर्तन ने पूरी तरह से सीटीएचटीटी-जीएफपी (चित्रा 2) के मायरिस्टोइलेशन को अवरुद्ध कर दिया था। चित्रा 1: क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर फैटी एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाना। HEK293T कोशिकाओं को संकेतित फैटी एसिड के साथ सीधे (गैर-सैप) या सैपोनिफिकेशन (सैप) के बाद इनक्यूबेट किया गया था और वाहक प्रोटीन बीएसए के साथ इनक्यूबेशन किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल 2.1-2.7 में वर्णित है। अल्काइनिल-फैटी एसिड को रसायन विज्ञान पर क्लिक करने के लिए प्रोटीन लिसेट के 100 μg के अधीन करके फ्लोरोसेंट एज़ाइड से जोड़ा गया था, जिसे एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था, और पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था। 0.1 M Tris pH 7.0 या 0.1 M KOH के साथ उपचार के बाद, थायोएस्टर बांड को रिवर्स करने के लिए, फैटी एसाइलेशन को फ्लोरोसेंट एज़ाइड का उपयोग करके पाया गया था। GAPDH का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था; विरोधी GAPDH rhodamine (1: 5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 2: क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर N-myristoylated ctHTT-GFP का पता लगाना। HEK293T कोशिकाओं को C-terminally छोटा (ct) और HTT (myr-ctHTT-GFP) के myristoylatable रूप के साथ संक्रमित किया गया था और alkynyl-myristate के साथ लेबल किया गया था। एक अलैनिन के साथ प्रतिस्थापित आवश्यक ग्लाइसिन के साथ एक गैर-myristoylatable रूप शामिल किया गया था (G2A)। कटाई और लाइसिस के बाद, सीटीएचटी-जीएफपी को बकरी एंटी-जीएफपी का उपयोग करके इम्यूनोप्रिसिपिटेट किया गया था। Lysates क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया (बाएं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मोतियों से रिहाई के बाद immunoprecipitates के अधीन थे. स्ट्रेप्टाविडिन एलेक्सा 680 (SA680) का उपयोग करके Myristoylation का पता लगाया गया था। जीएफपी को एंटी-खरगोश एलेक्सा 488 के साथ संयोजन में खरगोश विरोधी जीएफपी का उपयोग करके पाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 3: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की वर्कफ़्लो योजना. प्रोटोकॉल में मुख्य प्रयोगात्मक चरणों की वर्कफ़्लो बाह्यरेखा. कई बिंदुओं को नोट किया जाता है जहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

संस्कृति में कोशिकाओं के लिए फैटी एसिड के प्रत्यक्ष जोड़ के परिणामस्वरूप अघुलनशीलता, लिपिड की वर्षा, और लिपोटॉक्सिसिटी 40 हो सकती है। नतीजतन, कोशिकाओं में सीधे फैटी एसिड जोड़ने से न केवल खराब सेलुलर अपटेक और फैटी एसिड लेबल की कम उपलब्धता हो सकती है, बल्कि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में कमी आ सकती है, साथ ही साथ ऑफ-टारगेट मार्गों की सक्रियता भी हो सकती है। हालांकि, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए कई चयापचय लेबलिंग प्रोटोकॉल में फैटी एसिड का प्रत्यक्ष जोड़ और बड़ी संख्या में पामिटोइल-प्रोटिओम अध्ययन शामिल हैं, जो क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने का उपयोग करके शायद ही कभी फैटी एसिड लेबल को सैपोनिफाई करते हैं या उन्हें बीएसए 8,36 के साथ इनक्यूबेट करते हैं। इस तथ्य पर विचार करना महत्वपूर्ण है कि फैटी-एसाइलेटेड प्रोटीन के क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने की दक्षता और संवेदनशीलता फैटी एसिड एनालॉग्स के पर्याप्त सेलुलर अपटेक पर निर्भर करती है। इसलिए, यह अनुमान लगाना उचित है कि कोशिकाओं में खराब निगमन से फैटी एसिड लेबल की कम उपलब्धता के कारण कई एस-एसाइलेटेड प्रोटीन प्रोटिओमिक अध्ययनों में पता लगाने से बच सकते हैं, खासकर जब लंबी श्रृंखला फैटी एसिड 17-ODYA का उपयोग किया गया था। 17-ODYA, या alkynyl-stearate, इसकी वाणिज्यिक उपलब्धता और इसके शुरुआती उपयोग के कारण कई अध्ययनों के लिए पसंद का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला लेबल रहा है8,36। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के परिणामों से पता चलता है कि 17-ODYA के सैपोनिफिकेशन के परिणामस्वरूप एस-एसाइलेटेड प्रोटीन का पता लगाने में सबसे बड़ी वृद्धि होती है, जो कि छोटी श्रृंखला फैटी एसिड जैसे कि पामिटेट या माइरिस्टेट की तुलना में होती है। इसलिए, सैपोनिफाइड लेबल के साथ इन प्रयोगों को दोहराने से एस-एसिलेशन के अतिरिक्त सब्सट्रेट प्राप्त हो सकते हैं जिन्हें पहले अनदेखा किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि अधिकांश palmitoyl acyltransferases S-acylation के लिए palmitate पसंद करते हैं, कुछ में फैटी एसिड की अन्य लंबाई जैसे stearate15,38,44 के लिए प्राथमिकताएं होती हैं। इसके अलावा, कुछ प्रोटीन या यहां तक कि प्रोटीन के भीतर विशिष्ट साइटें एक फैटी एसिड को दूसरे 15,45 से अधिक पसंद करती हैं। इसलिए, 17-ODYA का उपयोग करने वाले अध्ययनों में प्रोटीन एस-एसाइलेटेड के प्रति पूर्वाग्रह हो सकता है, जो कि स्टीयरेट के साथ होता है, न कि पाल्मिटेट, जबकि कम पहचान के कारण उन प्रोटीनों का भी प्रतिनिधित्व करता है।

क्लिक रसायन विज्ञान के लिए बेहतर चयापचय लेबलिंग दक्षता लिपिड के सैपोनिफिकेशन और FAFBSA चरणों के साथ इनक्यूबेशन पर निर्भर करती है, साथ ही साथ delipidated FBS भी। सभी फैटी एसिड को KOH में पूरी तरह से saponified किया जाना चाहिए जिसमें FAFBSA के साथ इनक्यूबेशन के साथ आगे बढ़ने से पहले कोई दृश्यमान ठोस शेष नहीं होना चाहिए। यह एक कठिन कदम हो सकता है और समय महत्वपूर्ण है। सैपोनिफाइड फैटी एसिड 65 डिग्री सेल्सियस पर समाधान में जाने के बाद, तुरंत गर्म बीएसए जोड़ें क्योंकि आगे हीटिंग फैटी एसिड से डीएमएसओ के वाष्पीकरण का कारण बनेगी। इसके अलावा, सैपोनिफाइड लेबल जैसे ही यह ठंडा होना शुरू होता है, फिर से ठोस होना शुरू हो जाएगा। इसलिए, FAFBSA गर्म होना चाहिए और नमक घुलनशील होने के बाद तेजी से जोड़ा जाना चाहिए। कांच की प्रतिक्रिया शीशियों, और उनके आकार इस कदम के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे सैपोनिफाइड लिपिड को घुलनशील रहने के लिए पर्याप्त गर्म होने की अनुमति देते हैं, जबकि यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त शांत होते हैं कि एफएएफबीएसए congeal नहीं करता है। लेबलिंग के लिए एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में पिपेटिंग के माध्यम से पर्याप्त मिश्रण भी महत्वपूर्ण है।

क्लिक रसायन विज्ञान के लिए अभिकर्मकों को ठीक से संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है, आमतौर पर desiccants के साथ या N2 या Ar गैस के तहत -20 °C से -80 °C पर। एसाइलेशन सिग्नल या कमजोर सिग्नल की कमी अस्थिर अभिकर्मकों, विशेष रूप से पुराने टीबीटीए और एज़ाइड स्टॉक समाधानों के कारण हो सकती है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट एजाइड स्टॉक समाधानों के साथ देखभाल की जानी चाहिए, जिसे जितना संभव हो उतना प्रकाश से संरक्षित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, लिपिड अभाव की विधि और लेबलिंग समय जैसे चर को उपयोग किए जाने वाले सेल के प्रकार के आधार पर इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, न्यूरोनल कोशिकाओं को लंबे समय तक लेबलिंग समय की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि मीडिया परिवर्तन और लिपिड अभाव मुश्किल (अप्रकाशित) हैं।

इस प्रोटोकॉल का लाभ सबसे नाटकीय है जब लंबी श्रृंखला फैटी एसिड के लिए उपयोग किया जाता है। छोटी श्रृंखलाओं के लिए, सिग्नल तीव्रता में वृद्धि कम नाटकीय हो जाती है, लेकिन अभी भी कोशिकाओं के लिए सुरक्षात्मक होने की संभावना है। जबकि सुझाए गए संशोधन सामान्य रूप से प्रोटीन एसाइलेशन का पता लगाने में सुधार करेंगे, क्लिक रसायन विज्ञान को अभी भी एक लिपिड-केंद्रित विधि माना जाता है1 जो गतिशील रूप से पता लगाने तक सीमित है, न कि विशेष रूप से एस-एसाइलेटेड प्रोटीन 1। विचार करने के लिए अन्य सीमाओं में लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए फैटी एसिड अभाव की आवश्यकता शामिल है, और एसाइल-बायोटिन एक्सचेंज (एबीई) की तुलना में संगत सेल प्रकारों की अपेक्षाकृत सीमित सीमा एसाइल-एसाइलेशन 16 का पता लगाना। इन सीमाओं के बावजूद, क्लिक रसायन विज्ञान का पता लगाने सबसे एसाइल-एक्सचेंज assays की तुलना में तेज है और प्रोटीन का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल है जो एसाइल-एक्सचेंज एसेस के लिए आवश्यक दोहराए गए प्रोटीन वर्षा चरणों को सहन नहीं करते हैं। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को पल्स-चेस विश्लेषण 38 जैसे अन्य क्लिक assays का उपयोग करके एक साथ लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है।

क्लिक रसायन विज्ञान के लिए चयापचय लेबलिंग के लिए इस संशोधन के उपयोग ने एसाइलेटेड प्रोटीन, विशेष रूप से एस-एसाइलेटेड के समग्र पता लगाने में वृद्धि की, जिसमें विभिन्न प्रकार की प्रोटिओमिक तकनीकें हैं जो क्लिक रसायन विज्ञान के साथ संयोजन के रूप में उपयोग की जाती हैं। जैसा कि दिखाया गया है, फ्लोरोजेनिक डिटेक्शन का उपयोग बायोटिन के विकल्प के रूप में किया जा सकता है (चित्र1)28। यह विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि सेल लिसेट में कोई अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन नहीं है। इसके अलावा, फ्लोरोफोरस जो केवल क्लिक रसायन विज्ञान के बाद सक्रिय होते हैं, उनका उपयोग किया जा सकता है46। क्लिक रसायन विज्ञान लेबलिंग के लिए saponified और FAFBSA-बाउंड फैटी एसिड सेल में उपलब्ध लेबल की मात्रा में समग्र वृद्धि के कारण ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने में कठिनाइयों के साथ मदद कर सकता है और सीधे मीडिया में फैटी एसिड जोड़ने के विषाक्त प्रभावों को सीमित करके। इसका उपयोग कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री 27 के साथ संयोजन के रूप में भी किया जा सकता है, खासकर जब मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम का उपयोग करके हाल ही में हुई प्रगति के साथ लिया जाता है, जो कम बहुतायत प्रोटीन के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए अनावश्यक माप को रोकता है, जैसा कि मौजूदा डेटा-निर्भर अधिग्रहण के विपरीत है जो सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने का पक्ष लेता है47 . इसके अलावा, क्लिक रसायन विज्ञान को सेल संस्कृति (एसआईएलएसी) में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है और गतिशील प्रोटीन एस-एसाइलेशन 27 पर मात्रात्मक डेटा का उत्पादन करने के लिए पल्स-चेस विधियों को जोड़ा जा सकता है। अंत में, Hannoush समूह निकटता बंधाव परख (पीएलए) के साथ क्लिक रसायन विज्ञान संयुक्त करने के लिए एकल सेल विज़ुअलाइज़ेशन और palmitoylated प्रोटीन के उपकोशिकीय वितरण में परीक्षाओं की अनुमति देने के लिए43,48.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; आरजीपीआईएन-2019-04617)। लूसिया लियाओ द्वारा वित्त पोषित किया गया था राम और लेखा तुमकुर मेमोरियल छात्रवृत्ति वाटरलू विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विभाग के माध्यम से, और आईओडीई ओंटारियो के माध्यम से लुसी मॉरिसन मेमोरियल बर्सरी, वाटरलू विश्वविद्यालय से स्नातक अनुसंधान वित्त पोषण के अलावा स्नातक अनुसंधान छात्र (50503-11072), विज्ञान स्नातक पुरस्कार, और स्नातक शिक्षण सहायकता शामिल है। लेखक इस पांडुलिपि को तैयार करने में उनके समर्थन के लिए मार्टिन लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से स्टेफ़नी रयाल, हरलीन गिल और सादिया खान जिन्होंने शुरू में इन अध्ययनों की तैयारी में मार्टिन लैब स्थापित करने में मदद की। लेखकों को भी ctHTT-GFP निर्माणों और डॉ शॉन सैंडर्स पांडुलिपि तैयार करने में महत्वपूर्ण इनपुट के लिए तरह के उपहार के लिए डॉ Luc Berthiaume धन्यवाद करना चाहते हैं. चित्रा 3 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
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Referências

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Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
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