クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

1. 細胞培養 細胞培養用のDMEM(ダルベッコの改変イーグル培地)を補うには、10%ウシ胎児血清(FBS)、1xペニシリン-ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、および100mMピルビン酸ナトリウム(1%体積/体積)を加える。 6ウェル組織培養皿の約5 x 105 HEK293T細胞/ウェルをプレートし、5%CO2を含む37°C加湿インキュベーター内で18時間増殖させ、75%〜80%のコンフルエントに達する。 脂肪酸血清欠乏 ラベリングメディアを準備するには、上記のようにDMEMを10Sなしで準備します(ステップ1.1)。FBS を 5% デキストラン木炭コーティング FBS (DCC-FBS) に置き換えます。使用前に37°Cに予め加温してください。 室温で細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかに洗浄し、標識培地と交換する。注:HEK293T細胞は組織培養プレートから容易に剥離する。細胞を洗浄し、培地を交換するときは注意してください。インキュベーターへの移送中およびインキュベーターからの移動中の攪拌を可能な限り最小限に抑えます。 細胞を5%CO2 で37°Cのインキュベーターに戻し、脂肪酸による代謝標識を進める前に、約45分間(最低15分が有効)、最大60分間インキュベートします。 2. 脂肪酸類似体の調製およびケン化 DMSOで可溶化してアルキニル脂肪酸の原液を予め調製し、以下の濃度を達成し、-20°Cで保存する。 必要に応じて室温で解凍する。最高のパフォーマンスを得るための準備をN2 またはArの下に保管してください。アルキニルミリスチン酸(13-テトラデシン酸、13-TDYA):25mMアルキニルパルミチン酸(15-ヘキサデシン酸;15-HDYA):100mMアルキニルステアリン酸塩(17-オクタデシン酸;17-ODYA):100mM 20%脂肪酸遊離BSA(FAFBSA)を調製するために、50mL使い捨てチューブに2gのFAFBSAを秤量する。 予め加温した(37°C)DMEMで10mLまで持たせる。 エンドオーバーエンド回転またはボルテックスによって混合し、37°Cのウォーターバスに入れてFAFBSAを完全に溶解させる。 0.2 μm フィルターを使用して、培地をろ過滅菌します。 約1mL容量のアリコートし、-20°Cで保存する。 必要に応じて解凍し、使用前にウォーターバスで37°Cに温めてください。 脂肪酸および脂肪酸類似体の溶解度を高めるために、3mLガラス円錐形反応バイアル中で20%モル過剰の水酸化カリウム(KOH)と共にインキュベートすることによってケン化を行う。注:これらのバイアルは、FAFBSAが高熱から固まらないようにしながら、塩を可溶性に保つことを可能にします。ガラスの使用はまた、脂肪酸がプラスチックに付着するのを防ぎます。 少なくとも2 μLのアルキニル脂肪酸類似体を3 mL円錐形反応バイアルの底に直接ピペットで取り出します。使用した6ウェルプレートの1ウェルあたり2μLの脂質を調製する( 表1参照)。注:脂肪酸の疎水性のため、反応バイアルに分注する前に、所望の体積を数回引き上げてピペットの先端をコーティングするのが最善です。 1 M KOHをアルキニル脂肪酸標識の20%モル過剰に等しい濃度(13-TDYAの場合は30 mM、15-HDYAおよび17-ODYAの場合は120 mM)に希釈する。 等量の希釈されたKOH(1 μL:1 μL脂肪酸:KOH)をガラスの端の反応バイアルの底の近くに出して、KOHの分注された体積が脂肪酸と混合するようにする。 バイアルの蓋を閉じ、静かにタップして溶液を混合します。注:混合物は、特に脂肪酸の炭化水素鎖の長さが長くなるにつれて、迅速に固化する可能性がある。固体をピペッティングしないように注意してください(すなわち、ピペッティングによって混合しないでください)。 反応バイアルを65°Cで約5分間、または脂肪酸が取り込まれたらすぐに加熱する(溶液が透明になる)。注:ステアリン酸塩(17-ODYA)などの炭素数が高く、溶解度が低下している脂肪酸は、65°CでKOHに完全に取り込まれるためにより長いインキュベーション時間を必要とする場合があります。 必要に応じて70°Cまで温度を上げます。水風呂が一番です。液体が蒸発しすぎないように注意してください。 脂肪酸が溶液に入り、目に見える固体が残らなくなったら、ピペットで20FBSAを予備加温し、脂肪酸の体積比:KOH:FAFBSAが1:1:50になるようにして、BSA結合アルキニル脂肪酸の最終濃度を20倍にしました。 上下にピペッティングして混ぜる。この溶液は、通常、目に見える固体がなく、透明に見えます。注:通常、小さな固体は、37°Cでのインキュベーション後に溶液に入ります。 脂肪酸とFAFBSAを37°Cで15分間インキュベートする。注:この時点でのケン化ラベルは15分を超えて安定しています。   総媒体量(mL) 脂肪酸または脂肪酸類似体(μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) BSA結合ケン化標識の総体積(μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 表1:ケン化脂肪酸標識率。 脂肪酸標識のケン化のための脂肪酸、KOH、およびFAFBSAの実験体積は、使用した培地の体積に従った。 コントロールとして、手順 2.3 を繰り返します。アルキン標識のない脂肪酸を含む。 1/20 容量の 20x 脂肪酸-BSA コンジュゲートで細胞を飢餓培地 (通常、2 mL 培地/細胞中 100 μL) に直接標識して、最終濃度 1% BSA およびアルキニル – ミリスチン酸塩の場合は 25 μM、アルキニル – パルミチン酸およびアルキニル – ステアレートの場合は 100 μM の最終濃度を達成します。注: 付着した細胞への物理的外乱の量を最小限に抑えるには、培地に直接ピペッティングするのではなく、ピペットの先端にメディアの表面に近い液滴を形成します。アシル化阻害剤を使用する場合は、標識脂肪酸に少なくとも15分前に添加する。時間は、使用する細胞または阻害剤によって異なり得る。この工程にもケン化処理を使用することが推奨されています28。 比較のために、非ケン化脂質を2μL(またはケン化容量に相当)の非標識脂肪酸を飢餓培地に直接ピペッティングして添加する。 細胞をインキュベーターに戻し、3〜6時間インキュベートする。注:最適な標識タイミングは、細胞タイプまたは実験条件ごとに決定する必要があるかもしれません。インキュベーション時間が長くなると、リン脂質などの他の脂質基へのβ酸化および/または取り込みによって脂肪酸が分解される可能性があります28。 室温で1x PBSで細胞を穏やかに洗浄する。 500 μL エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) フリー修飾ラジオ免疫沈降アッセイ (RIPA) バッファー (0.1% SDS、50 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸 (HEPES) pH 7.4、150 mM NaCl、1% 非変性洗剤、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、2 mM MgCl2 を新たに添加した 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)、および 10 μg/μL ペプスタチン A (または EDTA 非含有完全プロテアーゼ阻害剤カクテル)) で細胞を回収し、溶解液を 4 °C で 15 分間揺らします。 溶解物を16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 上清を1.7 mL微量遠心チューブに集め、クリック反応を進行させる準備ができるまで-20°Cで保存する。メモ: プロトコルはここで一時停止できます。溶解物は-20°Cで最大1ヶ月間安定である。ただし、クリック反応をタイムリーに進めることをお勧めします。 洗剤適合性(DC)アッセイなどの製造業者のプロトコールに従って適切なアッセイを使用してタンパク質濃度を定量する。 3. 細胞溶解液に対するクリック反応 クリックケミストリー用の試薬を準備します。 トリス-(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(TBTA)をDMSOに溶解して2mMにする。乾燥剤を入れた小さなアリコートに-20°Cで最大2〜3ヶ月間保管してください。N2またはArの下に保存するのが最適です。 CuSO4をddH2O水に溶解して50mMを達成する。室温で最大2ヶ月間保存してください。 トリスカルボキシエチルホスフィン(TCEP)をddH2O水に250mMまで溶解する。4°Cの暗闇の中で保存し、クリック反応の直前に新鮮な50mM希釈液を作ります。 DMSO中に2mMのアジドを調製する。乾燥剤を入れた小さなアリコートを-20°Cで最大6ヶ月間保管してください。N2またはArの下に保存するのが最適です。注:3つ以上のポリエチレングリコール群を有する生成物がビオチンで最もよく作用することが観察された。 上記と同じ溶解バッファーを使用して、1.7 mL マイクロ遠心チューブ内の 50 ~ 100 μg のタンパク質溶解液を同じ容量に持ってきてください。注:反応容量はできるだけ小さくしてください(20-100 μL)。 各サンプルにドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加えて、最終1%濃度を達成します。 溶解物に添加した後の最終濃度が100 μM TBTA(2 mMストック)、1 mM CuSO4、(50 mMストック)1 mM TCEP(50 mMストック)、および100 μMアジドプローブ(2 mMストック)となるように、クリック試薬のマスターミックスを調製する。それに応じてストックソリューションを組み合わせます( 表2参照)。メモ: 順序は重要です。各成分の添加後に完全に混合する。 マスターミックスの適切なボリュームを溶解物に加える。上下にピペッティングして混ぜる。 37°Cの水浴中で暗所で30分間インキュベートする。時折攪拌/混合する。 全反応量(μL) ボリュームタンパク質(μL) Vol. TBTA (2 mM) (μL) Vol. CuSO4 (50 mM) (μL) Vol. TCEP (50 mM) (μL) Vol. アジドプローブ (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 表2:クリック試薬とタンパク質体積比。 クリックケミストリー試薬および対応するストック濃度の実験体積は、タンパク質試料の体積に加えて。 4. 免疫沈降タンパク質のクリック反応 あるいは、ビーズ上 またはオフ 側で免疫沈降(IP)タンパク質上でクリック反応を行うことができる。注:通常、ビーズ のクリックオフ を実行するとバックグラウンドが最も少なくなり、目的の新しいタンパク質をテストする場合に最適です。 目的のタンパク質に対する細胞のトランスフェクトは、この場合、野生型ミリストイル化C末端ハンチンチン(HTT)をG2A置換でGFP(myr−ctHTT-GFP)およびctHTT−GFPに融合させ、先に記載したようにリン酸カルシウムDNA共沈法を用いる41。 6ウェル組織培養プレートに2.5 x 105 細胞/ウェルのプレートを入れ、一晩で約70〜80%のコンフルエントになるまで増殖させる。 1.7 mL マイクロ遠心管に 2.5 μg DNA を 10 μL と 99.75 μL の分子グレードの H2O を加えて DNA ミックスを調製します。次いで、15.25 μL CaCl2を DNAミックスに滴下して加える。 DNA/CaCl2 混合物を、125 μL 2x HEPES緩衝生理食塩水(HBS、pH 7.0)を含む別のチューブに滴下しながら加え、混合する。 DNA/CaCl2/HBSミックスを細胞にゆっくりと加える。2〜4時間後、培地を交換し、一晩インキュベートする。ステップ 1.3-2.8 からラベル付けを続行します。 溶解バッファーに等量の500μgのタンパク質を調製する。 ctHTT-GFP用ウサギ抗GFPとインキュベートしてIPを4°Cで一晩回転させる。 溶解バッファーで事前に平衡化した 15 ~ 20 μL のプロテイン G ビーズを各チューブに追加し、4 °C でエンドオーバーエンドで 3 時間反応させます。 ビーズを溶解バッファーで洗浄し、45 μL 1% SDS 50 mM HEPESバッファーに再懸濁します。 ビーズを80°Cで15分間加熱し、チューブを反転させるか、約5分ごとに攪拌します。チューブを短時間回転させ、80°Cに戻します。 サンプルがまだ暖かいうちにタンパク質を含む上清を収集します。注:プロトコルはここで一時停止することができ、免疫沈降サンプルは、クリックケミストリーに使用しない場合、-20°Cまたは-80°Cで保存することができます。 43 μL の上清を 7 μL のクリック試薬のマスターミックスと反応させます。 ステップ3.2.3に記載したとおりに反応を進行させる。 5. SDS-PAGEとウェスタンブロッティング 25mMジチオスレイトール(DTT)を含む1xサンプルローディングバッファーを加え、95°Cで5分間加熱することにより反応を停止し、変性させた。メモ: 最大 100 mM DTT まで使用できます28。β-メルカプトエタノールはチオエステル結合を加水分解し、クリックされた脂肪酸類似体を除去する可能性があるため、S-アシル化タンパク質とともに使用しないでください。 サンプルを簡単にスピンダウンします。 ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEでタンパク質を二重に分離する。注:チオエステル結合の存在を確認するためにKOHによるアルカリ処理には2つのゲルが必要です。蛍光アジドプローブを使用する場合、アシル化は、ゲル内または示された励起チャネルを用いた転写後に検出することができる。 ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜への転写(メタノール中で活性化し、ddH2Oでリンスする – それぞれ5分間)を、25V、1.0A(一定)で30分間半乾燥転写装置で行う。 ddH2Oで膜を短時間すすぎた後、1つの複製膜をメタノール/水(9:1 v/v)で0.1 M KOHに浸し、もう1つをメタノール/水(9:1 v/v)の0.1 M Tris-HCl pH 7.0に浸し、室温で60分間穏やかに揺らします。 ddH2O水で膜を短時間すすぎ、続いてPBS-T(1x PBS、0.1% Tween 20)で5分間6回洗浄します。注:よく洗ってください。 膜を5%スキムミルクブロッキングバッファー(1x PBS、0.1% Tween20)で一晩ブロックします。 6. ウェスタンブロットの実行 指示された場合、蛍光タグ付きストレプトアビジン(1:5000)およびローディングコントロール、抗GAPDHローダミン(1:5000)を5%BSAブロッキングバッファー(0.01% SDS、1x PBS、0.1% Tween20)に室温で45〜60分間、暗闇の中で緩やかに揺らしながらプローブします。 免疫沈降タンパク質ブロットを、まず5%脱脂粉乳ブロッキングバッファー中の一次抗GFP抗体でプローブし、次いでステップ6.1のように5%BSA中の適切な二次抗体でプローブする。 PBS-T(1x PBS、0.1% Tween20)で膜を合計4回繰り返して5分間洗浄し、イメージング前にddH2O水ですすいでください。