JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

الدمج الأمثل لنظائر الأحماض الدهنية ألكينيل للكشف عن البروتينات الأسيلات الدهنية باستخدام Click Chemistry

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

دراسة الأسيل الدهني لها آثار مهمة في تفاعلات البروتين الخلوي والأمراض. يظهر هنا بروتوكول معدل لتحسين الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الأسيلية الدهنية ، والتي يمكن تطبيقها في أنواع مختلفة من الخلايا ودمجها مع فحوصات أخرى ، بما في ذلك مطاردة النبض وقياس الطيف الكتلي.

Abstract

الأسيل الدهني ، الإضافة التساهمية للأحماض الدهنية المشبعة إلى ركائز البروتين ، مهم في تنظيم عدد لا يحصى من الوظائف الخلوية بالإضافة إلى آثاره في السرطان والأمراض التنكسية العصبية. وقد مكنت التطورات الأخيرة في أساليب الكشف عن الأسيل الدهني من الكشف الفعال وغير الخطير عن البروتينات الأسيلية الدهنية، لا سيما من خلال استخدام كيمياء النقر مع وضع العلامات الحيوية المتعامدة عليها. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الكشف عن كيمياء النقر محدودا بسبب ضعف الذوبان والآثار السامة المحتملة لإضافة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة إلى مزرعة الخلايا. الموصوف هنا هو نهج وضع العلامات مع التسليم الأمثل باستخدام الأحماض الدهنية الصابونية في تركيبة مع BSA الخالية من الأحماض الدهنية ، وكذلك الوسائط الخالية من الدهون ، والتي يمكن أن تحسن الكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية التي يصعب اكتشافها. كان هذا التأثير أكثر وضوحا مع التناظرية ألكينيل ستيرات ، 17-ODYA ، والتي كانت التناظرية الأحماض الدهنية الأكثر استخداما في الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الأسيلاتية. سيؤدي هذا التعديل إلى تحسين الدمج الخلوي وزيادة الحساسية للكشف عن البروتين الأسيلي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا النهج في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ودمجه مع اختبارات أخرى مثل تحليل مطاردة النبض ، ووضع العلامات المستقرة على النظائر مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا ، وقياس الطيف الكتلي للتنميط الكمي للبروتينات الأسيلات الدهنية.

Introduction

يتضمن الأسيل الدهني الإضافة التساهمية للأحماض الدهنية إلى البروتينات وهو معروف جيدا بأهميته في تعزيز التفاعلات بين البروتين والغشاء ولكن ثبت أيضا أنه يعزز التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتغيرات التوافقية ، وينظم المواقع الحفازة للإنزيمات1،2،3،4،5،6،7 . وقد برز الأسيل الدهني كهدف دوائي محتمل في عدد لا يحصى من الأمراض، بما في ذلك العدوى والسرطان والالتهابات والتنكس العصبي، حيث تم توثيق الاضطرابات في بالميتويلاتيون8،9،10،11،12،13. وقد حفز ذلك في المقام الأول تطوير طرق جديدة للكشف عن المواد الكيميائية، مما مكن من تحديد أهداف البروتين الأسيل S على نطاق واسع.

يمكن أن يشمل الأسيل الدهني مجموعة متنوعة من التعديلات التي تنطوي على إضافة تساهمية للأحماض الدهنية المشبعة وغير المشبعة ، ولكنها تشير عادة إلى N-myristoylation و S-acylation. يشير N-myristoylation إلى إضافة حمض الميريستيك إلى الجلايسينات الطرفية N إما بشكل مشترك على الببتيدات المتعددة الناشئة أو بعد الترجمة على الجلايسينات N-terminal المكشوفة حديثا بعد الانقسام البروتيني 2,14. N-myristoylation يحدث من خلال رابطة أميد لا رجعة فيها. من ناحية أخرى ، يشير S-acylation عادة إلى الإضافة القابلة للانعكاس للأحماض الدهنية طويلة السلسلة إلى بقايا السيستين عبر رابطة الثيوستر. يتضمن الشكل الأكثر شيوعا لهذا التعديل دمج البالميتات ، وبالتالي ، يشار إليه عادة باسم S-palmitoylation ، أو ببساطة palmitoylation11,15. من نواح كثيرة ، يشبه S-palmitoylation الفسفرة. إنه ديناميكي ، منظم إنزيميا ، ويثبت أنه قابل للسحب للغاية.

حتى العقد الماضي ، كانت دراسة الأسيل الدهني تعوقها طرق الكشف المحدودة ، والتي تتطلب الأحماض الدهنية المصنفة إشعاعيا. كان لهذا العديد من العيوب ، بما في ذلك التكلفة وقضايا السلامة وأوقات الكشف الطويلة جدا. عادة ، تم استخدام إما بالميتات مثلثة أو باليود للكشف عن S-acylation16. يتطلب البالميتات المثلثة فترات كشف طويلة باستخدام فيلم التصوير الشعاعي الذاتي ، والذي يمكن أن يستغرق أسابيع إلى أشهر. في حين أن نظائر الأحماض الدهنية اليودو [125I] قصرت أوقات الكشف ، إلا أنها قدمت خطرا أعلى بكثير على السلامة وتطلبت مراقبة الغدة الدرقية عن كثب من المجربين. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هذه الطرق غير كمية ، وبالتالي ، تحد من القدرة على قياس النخيل الديناميكي ، وكذلك تستغرق وقتا طويلا في الإعداد والتنظيف بسبب معدات الحماية الشخصية الإضافية والمراقبة الإشعاعية. وأخيرا، لم تكن الملصقات المشعة مناسبة تماما للدراسات البروتينية وتقتصر عادة على الكشف عن انخفاض الإنتاجية لبروتينات معينة ذات أهمية. مع اكتشاف المزيد من الركائز ، وحتما تم تحديد الإنزيمات التي تتوسط في كل تعديل ، كان من الواضح أن هناك حاجة إلى طرق كشف جديدة17،18،19،20،21. في وقت واحد تقريبا ، نشأت عدة طرق جديدة للكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية. الأول يستغل انعكاس وتفاعل رابطة الثيوستر ل S-acylation. يستبدل اختبار تبادل الأسيل والبيوتين (ABE) كيميائيا البالميتات بالبيوتين للسحب اللاحق للبروتينات الأسيلية باستخدام حبات أغاروز أفيدين والكشف المباشر عن طريق اللطخة الغربية22،23،24. بعد ذلك ، تم تطوير وضع العلامات الحيوية المتعامدة للأحماض الدهنية والإضافة الانتقائية الكيميائية إلى العلامات أو المقابض التي تضمنت استخدام ربط Staudinger وكيمياء النقر25،26،27،28،29،30،31،32،33 . وأخيرا، وعلى غرار ABE، يستبدل الالتقاط بمساعدة راتنج الأسيل (RAC) بشكل أساسي المواقع ذات الأسيل S-acylated بحبات ثيول التفاعلية لالتقاط واكتشاف البروتينات الأسيلية S-acylated34,35. وقد وفرت الفحوصات القائمة على التبادل وكيمياء النقر معا طرقا أكثر كفاءة وحساسية للكشف عن الأسيل وتنقية التقارب للتحليل النهائي وأدت لاحقا إلى اكتشاف الآلاف من البروتينات الأسيلية S-acylated8,36.

يشمل مصطلح كيمياء النقر مجموعة من التفاعلات الكيميائية، ولكنه يشير بشكل شائع إلى آلية تفاعل الأزيدو-ألكين المحفزة Cu(I) [3+2] بين مجموعة ألكينيل ومجموعة أزيدو27،28،37. على وجه الخصوص ، في حالة الأسيل الدهني ، تتضمن كيمياء النقر الكشف عن S-palmitoylation أو N-myristylation من خلال دمج ألكينيل بالميتات الحيوي المتعامد 16-carbon (15-حمض سداسي أديسينويك ؛ 15-HDYA) أو ألكينيل ميريستات 14 كربون (13-tetradecynoic acid ؛ 13-TDYA) ، على التوالي ، في الخلايا لتسمية البروتينات الأسيلية الذاتية المنشأ28 . بعد تحلل الخلايا والترسيب المناعي للبروتين محل الاهتمام ، يتم إجراء تفاعل كيمياء نقرة (ارتباط تساهمي بين الألكين والأزيد) لربط مسبار تقارب ، عادة البيوتين ، للكشف عنه بواسطة اللطخة الغربية28,37. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء كيمياء النقر على إجمالي محللات الخلايا ويمكن تنقية البروتينات الأسيلية الدهنية لتحديد الهوية عن طريق قياس الطيف الكتلي. زاد تفاعل كيمياء النقر الأولي مع أزيدو البيوتين من انتقائية وحساسية الكشف أكثر من مليون مرة مقارنة بالنشاط الإشعاعي2. ميزة أخرى لكيمياء النقر هي أنه يمكن دمجها مع طرق وضع العلامات الكلاسيكية الأخرى ، مثل تحليل مطاردة النبض لدوران البروتين باستخدام azido-homoalanine للتحليل الكمي38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مجسات الفلورسنت بدلا من البيوتين أو غيرها من المجسات الكيميائية الحيوية ، مثل علامات FLAG أو Myc ، من أجل فحص توطين البروتين16،28،39.

على الرغم من السهولة النسبية لاستخدام كيمياء النقر، يمكن أن يكون الكشف محدودا بسبب انخفاض قابلية الذوبان والسمية المحتملة لاستخدام الأحماض الدهنية الحرة طويلة السلسلة في زراعة الخلايا40. على وجه الخصوص ، على الرغم من تفضيل البالميتات أثناء S-acylation لغالبية البروتينات ، فقد استخدمت العديد من الدراسات ستيرات الكربون 18 (حمض 17-octadecynoic – 17-ODYA) بدلا من البالميتات (15-HDYA) للكشف عن بروتينات S-acylated بسبب توافرها التجاري وتكلفتها المنخفضة نسبيا. ومع ذلك ، فإن 17-ODYA غير قابل للذوبان للغاية ويتطلب اهتماما خاصا عند استخدامه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتطلب كيمياء النقر بعض التحضير الدقيق وتخزين المواد الكيميائية. هنا ، يصف البروتوكول نهج وضع العلامات ، الذي يحسن التسليم باستخدام تصبن الأحماض الدهنية ، والتسليم باستخدام BSA الخالي من الأحماض الدهنية ، ومصل البقر الجنيني الخالي من الدهون (FBS) لزيادة قابلية الذوبان وتجاوز الآثار السامة المحتملة لإضافة الأحماض الدهنية الحرة إلى الخلايا 28. تعمل هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وقد استخدمت حتى في الحيوانات الحية28.

Protocol

1. زراعة الخلايا لتكملة DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) لزراعة الخلايا ، أضف 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1x البنسلين الستربتومايسين ، و 2 mM L-glutamine ، و 100 mM بيروفات الصوديوم (1٪ vol / vol). طبق ما يقرب من 5 × 105 خلايا HEK293T / بئر من طبق زراعة الأنسجة المكون من 6 آبار وينمو لمدة 18 ساعة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للوصول إلى 75٪ -80٪ التقاء. الحرمان من الأحماض الدهنية في المصل لإعداد وسائط وضع العلامات، قم بإعداد DMEM على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.1) بدون 10٪ FBS. استبدل FBS ب 5٪ من FBS (DCC-FBS) المطلي بالفحم (DCC-FBS). يسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. اغسل الخلايا بلطف باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة واستبدله بوسائط وضع العلامات.ملاحظة: تنفصل خلايا HEK293T عن ألواح زراعة الأنسجة بسهولة. توخي الحذر عند غسل الخلايا واستبدال الوسائط. قلل من الإثارة أثناء النقل من وإلى الحاضنة قدر الإمكان. أعد الخلايا إلى الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 واحتضنها حوالي 45 دقيقة (الحد الأدنى 15 دقيقة فعالة) ، حتى 60 دقيقة ، قبل الشروع في وضع العلامات الأيضية بالأحماض الدهنية. 2. إعداد وتصبن الأحماض الدهنية النظير تحضير محاليل المخزون من الأحماض الدهنية ألكينيل في وقت مبكر عن طريق الذوبان في DMSO لتحقيق التركيزات التالية وتخزينها في -20 درجة مئوية. تذوب في درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة. تخزين الاستعدادات للحصول على أفضل أداء لها تحت N2 أو Ar.ألكينيل ميريستات (13-حمض تيتريدسينويك، 13-TDYA): 25 ملليمترألكينيل بالميتات (15-حمض سداسي أديسينويك؛ 15-HDYA): 100 مللي مترستيرات الألكينيل (حمض أوكتاديسينويك 17-أوكتاديسينويك؛ 17-ODYA): 100 مللي متر لإعداد 20٪ خالية من الأحماض الدهنية BSA (FAFBSA) ، تزن 2 غرام من FAFBSA في أنبوب يمكن التخلص منه 50 مل. أحضر ما يصل إلى 10 مل مع DMEM المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). اخلطي عن طريق الدوران من طرف إلى طرف أو عن طريق الدوامة ، وضعيه في حمام مائي 37 درجة مئوية لإذابة FAFBSA تماما. استخدم مرشح 0.2 ميكرومتر لتصفية تعقيم الوسط. Aliquot في حوالي 1 مل حجم وتخزينها في -20 درجة مئوية. يذوب حسب الحاجة ويدفئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل الاستخدام. لتعزيز قابلية ذوبان نظائر الأحماض الدهنية والأحماض الدهنية ، قم بالتصبن عن طريق احتضان 20٪ من الفائض المولي من هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) في قوارير تفاعل مخروطية زجاجية سعة 3 مل.ملاحظة: تسمح هذه القوارير للملح بالبقاء قابلا للذوبان مع ضمان عدم احتكاك FAFBSA من الحرارة العالية. كما يمنع استخدام الزجاج الأحماض الدهنية من الالتصاق بالبلاستيك. ماصة من 2 ميكرولتر على الأقل من الأحماض الدهنية ألكينيل التناظرية مباشرة إلى الجزء السفلي من قارورة تفاعل مخروطي 3 مل. تحضير 2 ميكرولتر من الدهون لكل بئر من صفيحة من 6 آبار مستخدمة (انظر الجدول 1).ملاحظة: نظرا لكره الماء للأحماض الدهنية ، من الأفضل طلاء طرف الماصة عن طريق رسم الحجم المطلوب عدة مرات قبل توزيعه في قارورة التفاعل. قم بتخفيف 1 M KOH إلى تركيزات تساوي 20٪ من الفائض المولي من ملصق الأحماض الدهنية ألكينيل (30 mM ل 13-TDYA و 120 mM ل 15-HDYA و 17-ODYA). ماصة كمية متساوية من KOH المخفف (1 ميكرولتر : 1 ميكرولتر من الأحماض الدهنية : KOH) بالقرب من الجزء السفلي من قارورة التفاعل على حافة الزجاج ، بحيث يختلط الحجم المستغنى عنه من KOH مع الحمض الدهني. أغلق غطاء القارورة واضغط برفق لخلط المحاليل.ملاحظة: قد يتصلب الخليط بسرعة ، خاصة مع زيادة أطوال السلسلة الهيدروكربونية للحمض الدهني. احرص على عدم سحب المادة الصلبة (أي لا تخلط عن طريق السحب). سخني قارورة التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا ، أو بمجرد دمج الحمض الدهني (يصبح المحلول واضحا).ملاحظة: قد تتطلب الأحماض الدهنية التي تحتوي على عدد أكبر من الكربون وانخفاض قابلية الذوبان ، مثل ستيرات (17-ODYA) ، أوقات حضانة أطول ليتم دمجها بالكامل في KOH عند 65 درجة مئوية. ارفع درجة الحرارة إلى 70 درجة مئوية إذا لزم الأمر. الحمام المائي هو الأفضل. احرص على ألا يتبخر السائل كثيرا. بمجرد أن تدخل الأحماض الدهنية في المحلول ولا تبقى أي مواد صلبة مرئية ، تقوم الماصة بتسخين 20٪ FAFBSA بحيث تكون نسبة حجم الأحماض الدهنية: KOH: FAFBSA هي 1: 1: 50 لتحقيق تركيز نهائي من أحماض ألكينيل الدهنية المرتبطة ب BSA 20x. اخلطي عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. عادة ما يبدو الحل واضحا بدون مواد صلبة مرئية.ملاحظة: عادة ، ستدخل أي مواد صلبة صغيرة في محلول بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية. احتضان الأحماض الدهنية و FAFBSA لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: تكون التسمية الصابونية في هذه المرحلة مستقرة بعد 15 دقيقة.   إجمالي حجم الوسائط (مل) المجلد الأحماض الدهنية أو الأحماض الدهنية التناظرية (ميكرولتر) المجلد كوه (ميكرولتر) المجلد 20٪ FAFBSA (ميكرولتر) المجلد الكلي من التسمية الصابونية المترافقة مع BSA (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 الجدول 1: نسب وسم الأحماض الدهنية الصابونية. كميات تجريبية من الأحماض الدهنية ، KOH ، و FAFBSA لتصبن تسمية الأحماض الدهنية وفقا لحجم الوسائط المستخدمة. كعنصر تحكم، كرر الخطوة 2.3. مع الأحماض الدهنية دون تسمية الألكين. قم بتسمية الخلايا التي تحتوي على حجم 1/20 من الأحماض الدهنية 20x BSA المترافقة مباشرة على وسائط التجويع (عادة ، 100 ميكرولتر في 2 مل من الوسائط / الخلايا) لتحقيق تركيز نهائي قدره 1٪ BSA و 25 ميكرومتر للألكينيل ميريستات ، أو 100 ميكرومتر للألكينيل بالميتات والألكينيل ستيرات.ملاحظة: لتقليل مقدار الاضطراب المادي للخلايا المرفقة، قم بتشكيل قطرة عند طرف الماصة بالقرب من سطح الوسائط بدلا من سحبها مباشرة إلى الوسائط. إذا كنت تستخدم مثبطات الأسيل ، أضف 15 دقيقة على الأقل قبل الأحماض الدهنية الموسومة. قد تختلف الأوقات اعتمادا على الخلايا أو المثبطات المستخدمة. وقد أوصي باستخدام التصبن لهذه الخطوة أيضا28. للمقارنة ، أضف الدهون غير المصابة عن طريق سحب 2 ميكرولتر (أو ما يعادل حجم الصابون) من الأحماض الدهنية غير المصنفة مباشرة إلى وسائط الجوع. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة واحتضنها لمدة 3-6 ساعات.ملاحظة: قد يلزم تحديد التوقيت الأمثل لوضع العلامات لكل نوع خلية أو حالة تجريبية. يمكن أن تؤدي أوقات الحضانة الأطول إلى انهيار الأحماض الدهنية عن طريق أكسدة β و / أو دمجها في مجموعات دهنية أخرى ، مثل الدهون الفوسفاتية28. اغسل الخلايا بلطف باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة. حصاد وتحلل الخلايا مع 500 ميكرولتر من حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك الخالي من حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) الخالي من فحص الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) (0.1٪ SDS ، 50 mM N-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، 1٪ منظف غير محدد ، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم ، 2 mM MgCl2 مع فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) المضاف حديثا 1 mM ، و 10 ميكروغرام / ميكرولتر بيبستاتين A (أو كوكتيل مثبط للبروتياز الكامل الخالي من EDTA)) عن طريق هز الليزات لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بطرد الليزات مركزيا عند 16000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الفائقة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل وخزنها عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في تفاعل النقر.ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. Lysates مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. ومع ذلك ، يوصى بمتابعة تفاعل النقر في الوقت المناسب. حدد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة مناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، مثل الفحص المتوافق مع المنظفات (DC). 3. انقر فوق رد الفعل على محللات الخلية قم بإعداد الكواشف لكيمياء النقر. قم بإذابة أمين تريس (بنزيلتريازوليل ميثيل) (TBTA) في DMSO إلى 2 ملليمتر. تخزينها في aliquots صغيرة مع المجفف في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2-3 أشهر. يفضل تخزينها تحت N2 أو Ar. قم بإذابة CuSO4 في ماء ddH2O لتحقيق 50 ملليمتر. تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أشهر. يذوب تريس كاربوكسيثيلفوسفين (TCEP) في ماء ddH2O إلى 250 ملليمتر. يخزن في الظلام عند 4 درجات مئوية ويقوم بعمل تخفيفات جديدة بحجم 50 مللي متر قبل تفاعل النقر مباشرة. تحضير 2 مللي متر أزيد في DMSO. تخزينها في أليكوتس صغيرة مع المجفف في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. يفضل تخزينها تحت N2 أو Ar.ملاحظة: لوحظ أن المنتجات التي تحتوي على ثلاث مجموعات أو أكثر من جلايكولات البولي إيثيلين تعمل بشكل أفضل مع البيوتين. أحضر 50-100 ميكروغرام من محللات البروتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل إلى نفس الحجم باستخدام نفس المخزن المؤقت للتحلل كما هو موضح أعلاه.ملاحظة: حافظ على حجم التفاعل صغيرا قدر الإمكان (20-100 ميكرولتر). أضف كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى كل عينة لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 1٪. قم بإعداد مزيج رئيسي من كواشف النقر بحيث تكون التركيزات النهائية بعد الإضافة إلى الليزات هي: 100 ميكرومتر TBTA (مخزون 2 ملليمتر) ، 1 ملليمتر CuSO4 ، (مخزون 50 ملليمتر) 1 ملليمتر TCEP (مخزون 50 ملليمتر) ، ومسبار أزيد 100 ميكرومتر (مخزون 2 ملليمتر). الجمع بين حلول المخزون وفقا لذلك (انظر الجدول 2).ملاحظة: الترتيب مهم. تخلط تماما بعد إضافة كل مكون. أضف كميات مناسبة من المزيج الرئيسي إلى الليزات. اخلطي عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام في حمام مائي 37 درجة مئوية. إثارة / خلط من حين لآخر. إجمالي حجم التفاعل (ميكرولتر) حجم البروتين (ميكرولتر) المجلد TBTA (2 ملليمتر) (ميكرولتر) المجلد CuSO4 (50 ملليمتر) (ميكرولتر) المجلد TCEP (50 ملليمتر) (ميكرولتر) مسبار Vol. azido (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 الجدول 2: انقر فوق كاشف ونسب حجم البروتين. الأحجام التجريبية لكواشف كيمياء النقر وتركيزات المخزون المقابلة ، بالإضافة إلى أحجام عينات البروتين. 4. انقر فوق رد الفعل على البروتينات المناعية بدلا من ذلك ، من الممكن إجراء تفاعل النقر على البروتينات المناعية (IP) داخل أو خارج الخرز.ملاحظة: عادة ما يؤدي إجراء النقر على الخرز إلى أقل خلفية وهو الأفضل عند اختبار بروتينات جديدة ذات أهمية. خلايا النقل للبروتين محل الاهتمام ، في هذه الحالة ، تنصهر الحيوانات البرية من نوع myristoylated C-terminal huntingtin (HTT) مع GFP (myr-ctHTT-GFP) و ctHTT-GFP مع استبدال G2A ، باستخدام ترسيب الحمض النووي لفوسفات الكالسيوم ، كما هو موضح سابقا41. لوحة 2.5 × 105 خلية / بئر في لوحات زراعة الأنسجة 6 بئر وتنمو بين عشية وضحاها إلى ~ 70-80 ٪ التقاء. تحضير مزيج الحمض النووي عن طريق إضافة 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي في 10 ميكرولتر مع 99.75 ميكرولتر من الدرجة الجزيئية H2O إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.7 مل. ثم ، أضف 15.25 ميكرولتر CaCl2 قطرة إلى مزيج الحمض النووي. أضف خليط DNA / CaCl2 إلى أنبوب منفصل يحتوي على 125 ميكرولتر 2x HEPES محلول ملحي مخزن مؤقتا (HBS ، الرقم الهيدروجيني 7.0) بطريقة قطرية مع الخلط. أضف ببطء مزيج الحمض النووي / CaCl2 / HBS إلى الخلايا. بعد 2-4 ساعات ، استبدل الوسائط واحتضنها بين عشية وضحاها. تابع وضع العلامات من الخطوات 1.3 إلى 2.8. تحضير كميات متساوية من البروتين 500 ميكروغرام في المخزن المؤقت للتحليل. أداء IP عن طريق احتضان مع أرنب مضاد GFP ل ctHTT-GFP يدور بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. أضف 15-20 ميكرولتر من بروتين G الخرز المتوازن مسبقا مع المخزن المؤقت للتحلل إلى كل أنبوب واتركه يتفاعل من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات. اغسل الخرز باستخدام مخزن مؤقت للتحلل وأعد تعليقه في 45 ميكرولتر 1٪ SDS 50 mM HEPES المخزن المؤقت. سخني الخرز على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وقلبي الأنابيب أو حركيها كل 5 دقائق تقريبا. تدور الأنابيب لفترة وجيزة وتعود إلى 80 درجة مئوية. جمع supernatant التي تحتوي على البروتينات في حين أن العينات لا تزال دافئة.ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ويمكن تخزين العينات المترسبة مناعيا عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية، إذا لم يتم استخدامها لكيمياء النقر على الفور. اسمح ل 43 ميكرولتر من السوبرناتانت بالتفاعل مع مزيج رئيسي 7 ميكرولتر من كواشف النقر. تابع التفاعل كما هو مذكور في الخطوة 3.2.3. 5. SDS-PAGE والنشاف الغربي أوقف التفاعل ونزع الطبيعة عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحميل العينة 1x يحتوي على 25 mM dithiothreitol (DTT) وتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.ملاحظة: يمكن استخدام ما يصل إلى 100 mM DTT28. لا تستخدم β-mercaptoethanol مع بروتينات S-acylated لأنها يمكن أن تحلل روابط الثيوستر وتزيل الأحماض الدهنية التناظرية التي تم النقر عليها. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة. افصل البروتينات باستخدام SDS-PAGE على جل بولي أكريلاميد ، في نسختين مكررتين.ملاحظة: هناك حاجة إلى اثنين من المواد الهلامية للعلاج القلوي مع KOH لتأكيد وجود روابط الثيوستر. في حالة استخدام مسبار أزيد الفلورسنت ، يمكن اكتشاف الأسيل في الجل أو بعد النقل باستخدام قناة الإثارة المشار إليها. نقل إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (يتم تنشيطها في الميثانول وشطفها في ddH2O – 5 دقائق لكل منهما) مع جهاز نقل شبه جاف عند 25 فولت ، 1.0 أمبير (ثابت) لمدة 30 دقيقة. بعد شطف الأغشية لفترة وجيزة باستخدام ddH2O ، انقع غشاء مكرر واحد في 0.1 M KOH في الميثانول / الماء (9: 1 v / v) والآخر في 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 في الميثانول / الماء (9: 1 v / v) كعنصر تحكم غير قلوي لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. شطف الأغشية لفترة وجيزة في الماء ddH2O ، تليها 6 مرات من 5 دقائق يغسل في PBS-T (1x PBS ، 0.1 ٪ Tween 20).ملاحظة: يغسل جيدا. قم بسد الأغشية بين عشية وضحاها في مخزن مؤقت لمنع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (1x PBS ، 0.1٪ Tween20). 6. أداء لطخة الغربية حيثما أشير إلى ذلك، قم بإجراء مسبار باستخدام Streptavidin (1:5000) الموسومة بالفلورسنت والتحكم في التحميل، والرودامين المضاد ل GAPDH (1:5000) في مخزن مؤقت مانع BSA بنسبة 5٪ (0.01٪ SDS، 1x PBS، 0.1٪ Tween20) في درجة حرارة الغرفة لمدة 45-60 دقيقة مع هزاز لطيف، في الظلام. قم بفحص لطخة البروتين المترسب المناعي أولا باستخدام الأجسام المضادة الأولية المضادة ل GFP في مخزن مؤقت لمنع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ ، ثم باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 5٪ BSA كما هو الحال في الخطوة 6.1. اغسل الأغشية لمدة 5 دقائق في PBS-T (1x PBS ، 0.1٪ Tween20) ما مجموعه أربعة تكرارات وشطفها بالماء ddH2O قبل التصوير.

Representative Results

يمكن تصور الفرق في كفاءة وضع العلامات بين أحماض الألكنيل الدهنية الصابونية وغير الصابونية (غير النسغ) للكشف عن كيمياء النقر ومقارنتها بكثافة إشارة البروتينات الأسيلية الدهنية من خلال اللطخة الغربية (الشكل 1). لوحظ تأثير ملحوظ مع زيادة طول سلاسل الأسيل . في الخلايا الموسومة بستيرات الألكينيل (alk-stear) ، زاد تصبن الأحماض الدهنية والتسليم مع BSA لوضع العلامات الأيضية بشكل كبير من اكتشاف إشارة البروتين S-acylated من خلال كيمياء النقر والكشف عن طريق مسبار azido الفلورسنت (الشكل 1 ، على اليمين) ، مما يشير إلى زيادة عامة في الدمج الخلوي لتسمية الأحماض الدهنية alkynyl. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في الخلايا المعالجة بأقصر الأحماض الدهنية وأكثرها قابلية للذوبان ، alkynyl-myristate (alk-myr ؛ 13-tetradecynoic acid أو 13-TDYA). أظهرت الخلايا الموسومة بألكينيل بالميتات (الشكل 1 ، الوسط) زيادة متوسطة في التسمية مقارنة بألكينيل ميريستات (13-TDYA) ، ولكن أقل من ستيرات الألكينيل. الأهم من ذلك ، أن معالجة أغشية PVDF مع 0.1 M KOH أزالت إلى حد كبير ملصقات الأحماض الدهنية من الخلايا المحتضنة مع ألكينيل بالميتات وستيرات الألكينيل ، مما يؤكد أن غالبية الإشارة كانت من خلال رابطة استر أو ثيوستر (الشكل 1 ، الوسط واليمين ، الألواح السفلية). كما هو متوقع ، كان دمج ألكينيل ميريستات مقاوما في الغالب للقلويات (الشكل 1 ، اليسار ، الألواح السفلية) ، بسبب ارتباط الميريستات بالبروتينات من خلال رابطة أميد. يوضح الشكل 2 براعة وحساسية كيمياء النقر للكشف عن الأسيل الدهني للبروتينات المناعية. تم نقل خلايا HEK293T مع الهنتينجتين الطرفي C (HTT) الذي تم دمجه في GFP (myr-ctht-GFP) وتم تصنيفه مع ألكينيل ميريستات ، كما هو موضح سابقا18. بعد هطول الأمطار المناعية ، تم إطلاق ctHTT-GFP من الخرز وخضع لكيمياء النقر إلى جانب lysates. لم يتم اكتشاف myristoylation of wildtype (WT) myr-cthtt-GFP في الرواسب المناعية فحسب ، بل تم اكتشافه بقوة في lysates ، في حين أن طفرة G2A منعت تماما myristoylation من ctHTT-GFP (الشكل 2). الشكل 1: الكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية باستخدام كيمياء النقر. تم احتضان خلايا HEK293T بالأحماض الدهنية المشار إليها مباشرة (غير النسغ) أو بعد التصبن (النسغ) والحضانة مع البروتين الناقل BSA ، كما هو موضح في البروتوكول 2.1-2.7. تم ربط أحماض الألكينيل الدهنية بأزيد الفلورسنت عن طريق إخضاع 100 ميكروغرام من محللات البروتين للكيمياء النقرية ، مفصولة بواسطة SDS-PAGE ، ونقلها إلى أغشية PVDF. بعد العلاج باستخدام 0.1 M Tris pH 7.0 أو 0.1 M KOH ، لعكس روابط الثيوستر ، تم الكشف عن الأسيل الدهني باستخدام أزيد الفلورسنت. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. مكافحة GAPDH رودامين (1:5000). Alk-myr = 13-TDYA ، alk-pal = 15-HDYA ، alk-ste = 17-ODYA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الكشف عن N-myristoylated ctHTT-GFP باستخدام كيمياء النقر. تم نقل خلايا HEK293T مع C-terminally مبتورة (ct) وشكل myristoylatable من HTT (myr-ctHTT-GFP) وتم تصنيفها مع ألكينيل ميريستات. تم تضمين شكل غير myristoylatable مع استبدال الجلايسين الأساسي بألانين (G2A). بعد الحصاد والتحلل ، تم ترسيب ctHTT-GFP المناعي باستخدام الماعز المضاد ل GFP. تعرضت Lysates لتفاعل كيمياء النقر (يسار) وكذلك الرواسب المناعية بعد إطلاقها من الخرز. تم الكشف عن Myristoylation باستخدام Streptavidin Alexa 680 (SA680). تم الكشف عن GFP باستخدام الأرنب المضاد GFP في تركيبة مع مكافحة الأرانب Alexa 488. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: مخطط سير العمل للبروتوكول التجريبي. مخطط سير العمل للخطوات التجريبية الرئيسية في البروتوكول. ويلاحظ عدة نقاط يمكن فيها إيقاف البروتوكول مؤقتا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يمكن أن تؤدي الإضافة المباشرة للأحماض الدهنية إلى الخلايا في الثقافة إلى عدم الذوبان ، وهطول الأمطار من الدهون ، والسمية الشحمية40. وبالتالي ، فإن إضافة الأحماض الدهنية مباشرة إلى الخلايا قد لا يؤدي فقط إلى ضعف امتصاص الخلايا وانخفاض توافر ملصق الأحماض الدهنية ، ولكن أيضا انخفاض عدد الخلايا القابلة للحياة للتحليل النهائي ، وكذلك تنشيط المسارات خارج الهدف. ومع ذلك ، فإن العديد من بروتوكولات وضع العلامات الأيضية للكشف عن كيمياء النقر تتضمن إضافة مباشرة للأحماض الدهنية وعدد كبير من دراسات بالميتويل بروتينيوم باستخدام الكشف عن كيمياء النقر حتى الآن نادرا ما تصبن ملصقات الأحماض الدهنية أو تحتضنها باستخدام BSA8,36. من المهم النظر في حقيقة أن كفاءة وحساسية الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الدهنية الأسيلات تعتمد على امتصاص خلوي كاف لنظائرها من الأحماض الدهنية. لذلك ، من المعقول التكهن بأن العديد من البروتينات الأسيلية S قد تكون قد أفلتت من الكشف عنها في الدراسات البروتينية بسبب انخفاض توافر ملصقات الأحماض الدهنية من ضعف الدمج في الخلايا ، خاصة عند استخدام الحمض الدهني ذي السلسلة الأطول 17-ODYA. 17-ODYA، أو ألكينيل ستيرات، كانت العلامة المفضلة على نطاق واسع للعديد من الدراسات بسبب توافرها تجاريا واستخدامها في وقت مبكر8،36. ومع ذلك ، تظهر نتائج هذا البروتوكول أن تصبن 17-ODYA يؤدي إلى أكبر زيادة في الكشف عن بروتينات S-acylated ، مقارنة بالأحماض الدهنية ذات السلسلة الأقصر مثل Palmitate أو myristate. لذلك ، قد يؤدي تكرار هذه التجارب باستخدام ملصقات التصبن إلى ظهور ركائز إضافية من S-acylation التي ربما تم تجاهلها سابقا. علاوة على ذلك ، في حين أن معظم بالميتويل أسيل ترانسفيراز تفضل البالميتات ل S-acylation ، فإن البعض لديهم تفضيلات لأطوال أخرى من الأحماض الدهنية مثل ستيرات15،38،44. بالإضافة إلى ذلك ، تفضل بعض البروتينات أو حتى مواقع محددة داخل البروتينات حمضا دهنيا واحدا على آخر15,45. لذلك ، قد يكون للدراسات التي تستخدم 17-ODYA تحيز نحو البروتينات S-acylated مع ستيرات ، وليس بالميتات ، في حين أن تمثيل تلك البروتينات أقل بسبب انخفاض الكشف.

تعتمد كفاءة وضع العلامات الأيضية المحسنة لكيمياء النقر على تصبن الدهون والحضانة بخطوات FAFBSA ، بالإضافة إلى FBS المنزوع الدهون. يجب أن تكون جميع الأحماض الدهنية مصابنة تماما في KOH مع عدم وجود مواد صلبة مرئية متبقية قبل الشروع في الحضانة مع FAFBSA. يمكن أن تكون هذه خطوة صعبة والتوقيت أمر بالغ الأهمية. بعد أن تدخل الأحماض الدهنية الصابونية في محلول عند 65 درجة مئوية ، أضف BSA الدافئ على الفور لأن المزيد من التسخين سيؤدي إلى تبخر DMSO من الأحماض الدهنية. بالإضافة إلى ذلك ، سيبدأ الملصق الصابوني في إعادة التصلب بمجرد أن يبدأ في التبريد. لذلك ، يجب أن يكون FAFBSA دافئا ويضاف بسرعة بعد أن يصبح الملح قابلا للذوبان. قوارير التفاعل الزجاجية ، وشكلها مهمة لهذه الخطوة. فهي تسمح للدهون الصابونية بأن تكون دافئة بما يكفي لتظل قابلة للذوبان ، بينما تكون باردة بما يكفي لضمان عدم احتكاك FAFBSA. يعد الخلط الكافي عن طريق السحب مهما أيضا في هذه الخطوة لضمان حل متجانس لوضع العلامات.

يجب تخزين كواشف كيمياء النقر بشكل صحيح ، عادة مع المجففات أو تحت غاز N2 أو Ar عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية. قد يكون عدم وجود إشارة أسيلات أو إشارة ضعيفة بسبب الكواشف غير المستقرة ، وخاصة حلول TBTA و azide الأقدم للمخزون. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر مع حلول مخزون أزيد الفلورسنت ، والتي تحتاج إلى الحماية من الضوء قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتاج المتغيرات مثل طريقة الحرمان من الدهون ووقت وضع العلامات إلى الاختبار لتحديد الظروف المثلى اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. على سبيل المثال ، قد تحتاج الخلايا العصبية إلى أوقات أطول لوضع العلامات لأن تغيرات الوسائط والحرمان من الدهون صعبة (غير منشورة).

فائدة هذا البروتوكول هي الأكثر دراماتيكية عند استخدامها للأحماض الدهنية طويلة السلسلة. بالنسبة للسلاسل الأقصر ، تصبح الزيادة في شدة الإشارة أقل دراماتيكية ، ولكنها لا تزال على الأرجح واقية للخلايا. في حين أن التعديلات المقترحة ستحسن الكشف عن أسيل البروتين بشكل عام، إلا أن كيمياء النقر لا تزال تعتبر طريقة تتمحور حول الدهون1 تقتصر على الكشف عن البروتينات الأسيلية S-acylated ديناميكيا وليس بشكل ثابت1. وتشمل القيود الأخرى التي يجب مراعاتها شرط الحرمان من الأحماض الدهنية لتعزيز وضع العلامات، ونطاقه المحدود نسبيا من أنواع الخلايا المتوافقة عند مقارنته بالكشف عن تبادل الأسيل والبيوتين (ABE) ل S-acylation16. على الرغم من هذه القيود ، فإن اكتشاف كيمياء النقر أسرع من معظم اختبارات تبادل الأسيل وهو أكثر ملاءمة للكشف عن البروتينات التي لا تتسامح مع خطوات هطول الأمطار المتكررة للبروتين المطلوبة لاختبارات تبادل الأسيل . بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج هذا النهج مع وضع العلامات في وقت واحد باستخدام مقايسات نقر أخرى مثل تحليل مطاردة النبض38.

أدى استخدام هذا التعديل لوضع العلامات الأيضية لكيمياء النقر إلى زيادة الكشف الكلي عن البروتينات الأسيلية ، وخاصة S-acylated ، مع مجموعة متنوعة من التقنيات البروتينية التي تستخدم بالاقتران مع كيمياء النقر. كما هو موضح ، يمكن استخدام الكشف الفلوروجيني كبديل للبيوتين (الشكل 1) 28. هذا مفيد بشكل خاص لأنه لا توجد بروتينات فلورية داخلية في الليزات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفلوروفورات التي يتم تنشيطها فقط بعد كيمياء النقر46. يمكن أن يساعد الأحماض الدهنية الصابونية والمرتبطة ب FAFBSA لوضع العلامات على كيمياء النقر في التغلب على الصعوبات في اكتشاف البروتينات ذات الأهمية بسبب الزيادة الإجمالية في كمية الملصق المتاحة في الخلية وعن طريق الحد من الآثار السامة لإضافة الأحماض الدهنية مباشرة إلى الوسائط. كما يمكن استخدامه بالاقتران مع قياس الطيف الكتلي27 لزيادة الكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة، خاصة عندما تؤخذ جنبا إلى جنب مع التقدم الأخير باستخدام خوارزميات التعلم الآلي التي تمنع القياسات الزائدة عن الحاجة لزيادة الحساسية للبروتينات منخفضة الوفرة، بدلا من الاكتساب الحالي المعتمد على البيانات الذي يفضل الكشف عن البروتينات الأكثر وفرة47 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج كيمياء النقر مع وضع العلامات المستقرة على النظائر مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) وطرق مطاردة النبض لإنتاج بيانات قابلة للقياس الكمي عن البروتين الديناميكي S-acylation27. وأخيرا، جمعت مجموعة حنوش بين كيمياء النقر وفحص ربط القرب (PLA) للسماح بالتصور أحادي الخلية والفحوصات في التوزيع تحت الخلوي للبروتينات النخيلية43,48.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني لبحوث العلوم والهندسة (NSERC; RGPIN-2019-04617). تم تمويل لوسيا لياو من قبل منحة رام وليخا تومكور التذكارية من خلال قسم علم الأحياء في جامعة واترلو ، ومنحة لوسي موريسون التذكارية من خلال IODE Ontario ، بالإضافة إلى تمويل أبحاث الدراسات العليا من جامعة واترلو التي تضم منحة أبحاث الدراسات العليا (50503-11072) ، وجائزة الدراسات العليا للعلوم ، ومساعدة تدريس الدراسات العليا. يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر مارتن على دعمهم في إعداد هذه المخطوطة، وخاصة ستيفاني ريال، وهارلين جيل، وساديا خان الذين ساعدوا في البداية في إنشاء مختبر مارتن استعدادا لهذه الدراسات. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور لوك بيرثيوم على الهدية الكريمة لهياكل ctHTT-GFP والدكتور شون ساندرز على المدخلات النقدية في إعداد المخطوطة. تم إنشاء الشكل 3 باستخدام BioRender.com.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Zaballa, M. E., vander Goot, F. G. The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 1-31 (2018).
  2. Martin, D. D. O., Beauchamp, E., Berthiaume, L. G. Post-translational myristoylation: Fat matters in cellular life and death. Biochimie. 93 (1), 18-31 (2011).
  3. Hallak, H., et al. Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets. The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).
  4. O’Brien, P. J., Zatz, M. Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid. The Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).
  5. Liang, X., et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 276 (33), 30987-30994 (2001).
  6. Thinon, E., Percher, A., Hang, H. C. Bioorthogonal chemical reporters for monitoring unsaturated fatty-acylated proteins. ChemBioChem. 17 (19), 1800-1803 (2016).
  7. Veit, M., Reverey, H., Schmidt, M. F. G. Cytoplasmic tail length influences fatty acid selection for acylation of viral glycoproteins. Biochemical Journal. 318 (1), 163-172 (1996).
  8. Sanders, S. S., et al. Curation of the mammalian palmitoylome indicates a pivotal role for palmitoylation in diseases and disorders of the nervous system and cancers. PLOS Computational Biology. 11 (8), 1004405 (2015).
  9. Hannoush, R. N. Synthetic protein lipidation. Current Opinion in Chemical Biology. 28, 39-46 (2015).
  10. Martin, D. D. O., Hayden, M. R. Post-translational myristoylation at the cross roads of cell death, autophagy and neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 43 (2), 229-234 (2015).
  11. Young, F. B., Butland, S. L., Sanders, S. S., Sutton, L. M., Hayden, M. R. Putting proteins in their place: Palmitoylation in Huntington disease and other neuropsychiatric diseases. Progress in Neurobiology. 97 (2), 220-238 (2012).
  12. Hansen, A. L., Mukai, K., Schopfer, F. J., Taguchi, T., Holm, C. K. Sting palmitoylation as a therapeutic target. Cellular & Molecular Immunology. 16 (3), 236-241 (2019).
  13. Veit, M. Palmitoylation of virus proteins. Biology of the Cell. 104 (9), 493-515 (2012).
  14. Jiang, H., et al. Protein lipidation: Occurrence, mechanisms, biological functions, and enabling technologies. Chemical Reviews. 118 (3), 919-988 (2018).
  15. Greaves, J., et al. Molecular basis of fatty acid selectivity in the zDHHC family of S-acyltransferases revealed by click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (8), 1365-1374 (2017).
  16. Gao, X., Hannoush, R. N. A decade of click chemistry in protein palmitoylation: Impact on discovery and new biology. Cell Chemical Biology. 25 (3), 236-246 (2018).
  17. Tsutsumi, R., Fukata, Y., Fukata, M. Discovery of protein-palmitoylating enzymes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 456 (6), 1199-1206 (2008).
  18. Roth, A. F., Feng, Y., Chen, L., Davis, N. G. The yeast DHHC cysteine-rich domain protein Akr1p is a palmitoyl transferase. The Journal of Cell Biology. 159 (1), 23-28 (2002).
  19. Lobo, S., Greentree, W. K., Linder, M. E., Deschenes, R. J. Identification of a Ras Palmitoyltransferase in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41268-41273 (2002).
  20. Ohno, Y., Kihara, A., Sano, T., Igarashi, Y. Intracellular localization and tissue-specific distribution of human and yeast DHHC cysteine-rich domain-containing proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1761 (4), 474-483 (2006).
  21. Huang, K., et al. Huntingtin-interacting protein HIP14 Is a palmitoyl transferase involved in palmitoylation and trafficking of multiple neuronal proteins. Neuron. 44 (6), 977-986 (2004).
  22. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. BioTechniques. 36 (2), 276-285 (2004).
  23. Roth, A. F., Wan, J., Green, W. N., Yates, J. R., Davis, N. G. Proteomic identification of palmitoylated proteins. Methods. 40 (2), 135-142 (2006).
  24. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2 (7), 1573-1584 (2007).
  25. Martin, D. D. O., et al. Rapid detection, discovery, and identification of post-translationally myristoylated proteins during apoptosis using a bio-orthogonal azidomyristate analog. The FASEB Journal. 22 (3), 797-806 (2007).
  26. Kostiuk, M. A., et al. Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue. The FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).
  27. Martin, B. R., Wang, C., Adibekian, A., Tully, S. E., Cravatt, B. F. Global profiling of dynamic protein palmitoylation. Nature Methods. 9 (1), 84-89 (2012).
  28. Yap, M. C., et al. Rapid and selective detection of fatty acylated proteins using ω-alkynyl-fatty acids and click chemistry. Journal of Lipid Research. 51 (6), 1566-1580 (2010).
  29. Hang, H. C., Wilson, J. P., Charron, G. Bioorthogonal chemical reporters for analyzing protein lipidation and lipid trafficking. Accounts of Chemical Research. 44 (9), 699-708 (2011).
  30. Thinon, E., et al. Global profiling of co- and post-translationally N-myristoylated proteomes in human cells. Nature Communications. 5 (1), 4919 (2014).
  31. Charron, G., Wilson, J., Hang, H. C. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (4), 382-391 (2009).
  32. Hang, H. C., et al. Chemical probes for the rapid detection of fatty-acylated proteins in mammalian cells. Journal of the American Chemical Society. 129 (10), 2744-2745 (2007).
  33. Heal, W. P., et al. Site-specific N-terminal labelling of proteins in vitro and in vivo using N-myristoyl transferase and bioorthogonal ligation chemistry. Chemical Communications. (4), 480-482 (2007).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (ABE). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e50031 (2013).
  36. Blanc, M., et al. SwissPalm: Protein palmitoylation database. F1000Research. 4, 261 (2015).
  37. Heal, W. P., Wickramasinghe, S. R., Leatherbarrow, R. J., Tate, E. W. N -Myristoyl transferase-mediated protein labelling in vivo. Organic & Biomolecular Chemistry. 6 (13), 2308-2315 (2008).
  38. Lin, D. T. S., Conibear, E. ABHD17 proteins are novel protein depalmitoylases that regulate N-Ras palmitate turnover and subcellular localization. eLife. 4, 11306 (2015).
  39. Charron, G., et al. Robust fluorescent detection of protein fatty-acylation with chemical reporters. Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).
  40. Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: Problems and solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (2), 143-151 (2018).
  41. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
  42. Martin, B. R., Cravatt, B. F. Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells. Nature Methods. 6 (2), 135-138 (2009).
  43. Gao, X., Hannoush, R. N. Single-cell in situ imaging of palmitoylation in fatty-acylated proteins. Nature Protocols. 9 (11), 2607-2623 (2014).
  44. Muszbek, L., Haramura, G., Cluette-Brown, J. E., Cott, E. M. V., Laposata, M. The pool of fatty acids covalently bound to platelet proteins by thioester linkages can be altered by exogenously supplied fatty acids. Lipids. 34, 331-337 (1999).
  45. Brett, K., et al. Site-specific S-Acylation of influenza virus hemagglutinin. The location of the acylation site relative to the membrane border is the decisive factor for attachment of stearate. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34978-34989 (2014).
  46. Shieh, P., et al. CalFluors: A universal motif for fluorogenic azide probes across the visible spectrum. Journal of the American Chemical Society. 137 (22), 7145-7151 (2015).
  47. Pelletier, A. R., et al. MealTime-MS: A machine learning-guided real-time mass spectrometry analysis for protein identification and efficient dynamic exclusion. bioRxiv. , 110726 (2020).
  48. Gao, X., Hannoush, R. N. Method for cellular imaging of palmitoylated proteins with clickable probes and proximity ligation applied to Hedgehog, tubulin, and Ras. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4544-4550 (2014).

Tags

Alkynyl Fatty Acid AnalogsClick ChemistryFatty Acylated ProteinsFatty Acid LabelingMetabolic LabelingHEK-293 T-cellsBSA-bound Fatty AcidsSaponificationPotassium HydroxideFatty Acid-free BSA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image