I följande arbete beskriver vi de på varandra följande stegen som krävs för att etablera en stor biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer.
Mot bakgrund av den växande kunskapen om cancers inter-individuella egenskaper och heterogenitet kräver det framväxande området personlig medicin en plattform för preklinisk forskning. Under de senaste åren har vi etablerat en biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer bestående av primär tumörvävnad, normal vävnad, serum, isolerade perifera blodlymfocyter (PBL), patient-härledda xenografter (PDX), samt primära och sekundära cancer cellinjer. Eftersom den ursprungliga tumörvävnaden är begränsad och etableringshastigheten för primära cancercelllinjer fortfarande är relativt låg, tillåter PDX inte bara bevarande och förlängning av biobanken utan också genereringen av sekundära cancercelllinjer. Dessutom har PDX-modeller visat sig vara den perfekta in vivo-modellen för preklinisk drogtestning. Biobanking kräver dock noggrann förberedelse, strikta riktlinjer och en väl anpassad infrastruktur. Kolektomi, duodenopancreatectomy eller resected metastaser exemplar samlas omedelbart efter samband och överförs till patologi avdelningen. Med respekt för prioriteringen av en opartisk histopatologisk rapport, efter eget gottfinnande av den deltagande patologen som utför dissekeringar, små tumör bitar och icke-tumör vävnad skördas.
Nekrotiska delar kasseras och den återstående tumörvävnaden skärs i små, identiska kuber och kryopreserveras för senare användning. Dessutom är en liten del av tumören hackad och ansträngd för primär cancercellskultur. Dessutom behandlas blodprover som tagits från patienten pre- och postoperatively för att erhålla serum och PBLs. För PDX-engraftment tinas och implanteras de kryopreserverade exemplaren subkutant i flankerna av immunbristmöss. Den resulterande PDX recapitulate histologin av “givaren” tumörer och kan antingen användas för efterföljande xenografting eller cryopreserved för senare användning. I följande arbete beskriver vi de enskilda stegen för skapande, underhåll och administrering av en stor biobank av kolorektal och bukspottskörtelcancer. Dessutom lyfter vi fram de avgörande detaljer och varningar som är förknippade med biobanking.
Under de senaste åren har den samlade kunskapen om cancerns morfologiska, kliniska och genetiska egenskaper lett till uppfattningen om cancer som en heterogen, individuell sjukdom. Följaktligen har mutational karakterisering av tumörer, förutom kliniska och patologiska funktioner, fått betydelse för kliniskt beslutsfattande och många riktade terapier utvecklades för olika molekylära förändringar. Till exempel kan effekten av cetuximab vid kolorektal cancerbehandling förutsägas genom analys av KRAS och PIK3CA mutationsstatus1. Precisionsmedicin syftar till ett skräddarsytt tillvägagångssätt för att ge högsta behandlingssvar hos varje patient och undvika toxicitet hos inefficacious terapier2. Biobanker innehåller vävnad, blod och andra biologiska material hos cancerpatienter, som är kopplade till kliniska data, och är därmed ett utmärkt verktyg för translationell cancerforskning. På grund av det stora antalet kliniska prover möjliggör biobanker påvisande av sällsynta, men potentiellt läkemedelspliktiga mutationer, vilket ger nya behandlingsmöjligheter för den enskilda patienten3.
För att täcka ett så brett forskningsspektrum som möjligt begränsade vi inte vår aktivitet enbart vid provskörd, utan fokuserade på etablering av patientbaserade cancercelllinjer och xenografter (PDX). Traditionella 2D-cellinjer förblir hörnstenen i in vitro-forskning och är det främsta valet för storskaligadrogscreeningar 4,5. Dessutom är celllinjeanalys ofta enklare, billigare och mer lättillgänglig. Dessutom, eftersom patienten-härledda perifert blod lymfocyter (PBL) finns tillgängliga, kan även tumör immunologi studeras in vitro6. Majoriteten av nyutvecklade läkemedel med lovande preklinisk effektivitet i cellbaserade in vitro- eller in vivo-experiment har dock visat nedslående resultat i kliniska prövningar7. Däremot har prekliniska studier baserade på PDX in vivo-studier återspeglat den kliniska aktiviteten hos antineoplastiska medel mycket mer troget8. Eftersom PDX-vävnad nära återspeglar donatortumörens histologiska och molekylära egenskaper är PDX-modeller ett bra sätt att sprida de ofta mycket begränsade mängderna livskraftig tumörvävnad för att upprätthålla integriteten hos en biobank och för att möjliggöra utbyte av prover mellan forskargrupper och institutioner. Dessutom kan cancercelllinjer som härrör från PDX-vävnad etableras betydligt lättare än primära cancercellslinjer9. Under de senaste åren har vår arbetsgrupp inrättat en omfattande integrerad biobank för kolorektal- och bukspottskörtelcancer genom att stegvis standardisera och optimera arbetsflödet för alla biologiska prover i fråga (figur 1).
Bild 1:Biobankens arbetsflöde och organisation Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Genereringen av en levande biobank förutsätter, förutom att följa de rättsliga bestämmelserna om integritet, medicinsk rätt och djurskydd, en bra infrastruktur och ett väl samordnat team. Det har visat sig fördelaktigt att direkt involvera en del av den kirurgiska personalen i forskningsförfarandena, eftersom de mycket väl kan bedöma lämpligheten hos den enskilda patienten för vävnadsdonation. Dessutom tenderar patienter att samtycka till biobankning oftare, när deras skriftliga godkännande erhålls inom ramen för den kirurgiska informerade samtyckesdiskussionen. För att spara tid och resurser bör fall som förmodligen kommer att ge otillräckliga mängder tumörvävnad inte väljas för biobanking. När det gäller provförvärv är maximen “kommunikation är nyckeln” en enkel, men ofta förbisedd sanning. Det krävs bara en enda oinformerad teatersköterska eller kirurgisk kollega för att förstöra exemplaret redan från början genom att fortsätta som vanligt och lägga till formaldehyd till sambandsprovet. Därför är det helt avgörande att varje enskild medlem av den berörda personalen bekantar sig med SOP för biobanking. Kirurger bör märkas dagen före och precis i början av proceduren om planerad vävnadsuppsamling. Dessutom bör fall som valts ut för biobanking lyftas fram i den elektroniska ELLER-planen. Vävnadsskörd från det kirurgiska provet bör utföras av en patolog. För det första kommer detta att säkerställa att vävnadsskörden inte stör den slutliga patologiska rapporten. För det andra ökar detta sannolikheten för att få vävnad med tillräckliga mängder livskraftig cancervävnad. Särskilt i bukspottskörtelcancer med en uttalad desmoplastisk reaktion och frekventa nekrotiska områden är livskraftiga delar svåra att identifiera makroskopiskt för det otränade ögat. Som ett undantag från denna regel, vävnad block från stora lever eller pulmonal metastaser, kan ibland strukits “back-table” av kirurgen, om kirurgiska marginaler kan definieras makroskopiskt. Ändtarmscancer som återförsluts av total mesorektal excision (TME), kanske inte är lämplig för biobanking, eftersom vävnadsskörd från det återförslutna provet före paraffininbäddning kan störa TME:s kvalitetsbedömning. Alternativt kan vävnad för biobanking förvärvas genom transanal biopsi av rektal cancer.
Etableringsgraden för primära cellkulturer som härrör från den ursprungliga tumören är i allmänhet låg. PDX-härledda, sekundära cellkulturer kan mer sannolikt etableras. Vi rekommenderar testning av olika medier för varje enskilt fall och användning av antibiotikatillskott för de första passagerna för att minska föroreningen till ett minimum eftersom den skördade vävnaden sällan är steril. Efter framgångsrik förökning bör varje enskild cellinje bekräftas som en cancercelllinje genom FACS-analys och regelbundet testas för mykoplasmaförorening. För att utesluta korskontaminering rekommenderas regelbunden STR-analys. Det bör noteras att etableringsprotokollet för primära och sekundära cellinjer ständigt utsätts för optimering. Detaljer om enskilda mediers sammansättning och framgångsgrad ligger klart utanför detta arbetes tillämpningsområde och kommer att offentliggöras separat.
För PDX engraftment, tumör vävnad kan antingen implanteras direkt efter samband eller cryopreserved i fetala kalv serum med 10% DMSO eller liknande frysande medier för fördröjd implantation. Implantation omedelbart vid tumör vävnad skörd sätter en påfrestning på logistik och laboratoriepersonal, och xenografting resultat efter cryopreservation är inte sämre alls 10. Dessutom ökar inkubationen av vävnaden i Matrigel före tumörimplantation avsevärt engraftmenthastigheter12. Vi rekommenderar fördröjd engraftment efter bestämda patologiska konstaterande och omedelbar bortskaffande av felaktigt insamlade vävnad exemplar. Eftersom framgångsgraden för primär engraftment ökar med immunbrist hos mottagarmusen tenderar vi att använda NSG-möss för den allra första PDX-passagen. Efter den första framgångsrika PDX-ingraftmenten kan och bör NMRInu/nu-möss användas för efterföljande passager och vävnadsexpansion. Denna stam är mer robust, billigare och lättare att odla jämfört med NSG eller liknande immunbriststammar, men visar fortfarande rimliga engraftmenthastigheter. Dessutom underlättar dess nakenhet implantation och tumörtillväxtövervakning. För att öka engraftmenthastigheten i efterföljande passager rekommenderar vi direkt överföring av nyskördade PDX-vävnader för att vara värd för möss när det är möjligt, särskilt för långsamt växande PDX och fall med låg primär engraftment framgångsgrad. Collins och Lang granskade nyligen 14 studier av kolorektal PDX etablering och rapporterade engraftment priser varierar från 14 till 100% med en median PDX etableringsgrad på 68%, den senare överensstämmer med våra resultat13. I linje med litteraturen observerade vi lägre etableringshastigheter för bukspottkörtel jämfört med kolorektalcancer PDX14. Oavsett värdmus stam och tumör enhet, utväxten av mänskliga, Epstein-Barr Virus (EBV)-associerade B-cells lymfom och murin lymfom vid implantationssidan utgör en viktig fallgrop15,16. Om okänd, sådana tumörer kan “förorena” efterföljande passager och därmed förvirra på varandra följande resultat. Ovanligt snabb PDX tillväxt och svullnad av massundersökning, axillar och ljumskar lymfkörtlar är starka indikatorer på murin lymfom tillväxt, men regelbunden histologisk undersökning av PDX är ändå tillrådligt. Dessutom bör genetisk överensstämmelse mellan PDX och motsvarande donatorpatient testas regelbundet genom STR-analys. Helst bör biobanken kopplas till en klinisk databas som omfattar patienters egenskaper (allmän information, överlevnad, återfallsfri överlevnad, terapi, sekundär neoplasi etc.). På grund av rättsliga bestämmelser om integritetsskydd och brist på en sådan anonymiserad databas administreras och uppdateras vår kliniska datauppsättning regelbundet manuellt av de samarbetsvilliga läkarna.
Medan konventionella biobanker är begränsade till observatorieforskning, ger en levande biobank möjlighet till in vitro- och in vivo-interventioner. Patientbaserade cellinjer är ett viktigt verktyg för grundforskning, läkemedelsscreening med hög genomströmning och bedömning av nyaläkemedelsmedel 4. Motsvarande PDX-modeller är dock av ökande betydelse, eftersom de nära rekapitulerar histologin hos den ursprungligatumören 17,18 och visar en hög genetisk stabilitet över flera passager19,20. Vår PDX biobank har visat sig vara en utmärkt plattform för preklinisk och grundforskning6,21. Eftersom stora PDX-samlingar på ett adekvat sätt återspeglar patientpopulationens interpersonella heterogenitet har pdx-metoden (pct) (ett djur per modell och behandling) fått betydelse för läkemedelsutvecklingen eftersom det möjliggör trofast förutsägelse av kliniskt svar på nya läkemedel och kombinatorisk regim8. Vi utvärderar också för närvarande nya experimentella läkemedel i små PCT-studier.
Trots dessa lovande resultat hindrar medianinrättningens varaktighet på 12, 2 månader, pdx-modellernas kliniska tillämplighet som “avatarmöss” för testning av behandlingsalternativ mot cancer, åtminstone för de patienter som behöver omedelbar adjuvans eller till och med neoadjuvant behandling22. En ytterligare nackdel med standard PDX-modeller är bristen på användbarhet för immunterapitestning på grund av värdmössens immunbrist. För att övervinna dessa begränsningar har flera “humaniserade” musstammar utvecklats. Dessa möss är kraftigt immunkomprometterade, men kan rekonstitueras med olika typer av mänskliga benmärgs-härledda celler eller CD34+ hematopoetiska stamceller efter PDX utväxt23, vilket möjliggör utvärdering av lymfocytmedierad cytotoxicitet och behandlingssvar mot immun checkpoint-hämmarebehandling24,25.
Under de senaste åren har patientbaserade organoider (PDO) dykt upp som viktiga cancermodeller som konkurrerar med PDX. Härrör från intakt tumör bitar och odlas i en extracellulär matris byggnadsställning, återspeglar dessa tredimensionella strukturer nära de histologic och genetiska egenskaperna hos den ursprungliga tumör. Möjligheten till långsiktig expansion och kryopreservation gör PDO till ett idealiskt komplement till en levande biobank26,27. Förutom en relativt hög etableringsgrad har tillförlitlig läkemedelsresponsförutsägelse rapporterats för PDO för flera tumörenheter28. Dessutom har PDO till och med genererats från cirkulerande tumörceller och även samtidig etablering av organoider från motsvarande friska vävnad är möjlig, vilket möjliggör bedömning av behandlingsrelaterad toxicitet på patient-individuell basis29,30. Men jämfört med konventionella 2D-cellkulturer är organoidkultur tidskrävande och resurskrävande och konstgjorda extracellulära matrisföreningar kan störa vissa analytiskaförfaranden 31. Dessutom är cancerorganoider mottagliga för överväxt genom snabbare växande, icke-maligna organoider som härrör från hälsosamt epitel30. På grund av brist på stroma, blodkärl och immunceller är PDO mestadels oanvändbara för testning av antiangiogena immunterapeutiska medel. Ändå tillåter nya odlingsmetoder modellering av tumörmikromiljö in vitro, vilket gör PDO: er till en sann utmanare för PDX-modellerna32. Inom en snar framtid kommer patient-individuella tumörmodeller, i kombination med kraftfulla genetiska verktyg som nästa generations sekvensering, förhoppningsvis att bana väg för sann precisionsmedicin och skräddarsydda behandlingsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Jenny Burmeister, vår grafiska assistent, för inspelning och redigering av videon. Vidare tackar vi våra kollegor på kirurg- och patologiska avdelningen för det långvariga samarbetet. Vi vill också tacka Marcus Müller, produktionschef för IT- och mediecentret, University of Rostock, för att ha levererat ljudinspelningsutrustningen och förfinat ljudkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyska cancerhjälpsstiftelsen (DKH e.V.), bidragsnummer 108446 och bidragsnummer TBI-V-1-241-VBW-084 från staten Mecklenburg-Vorpommern finansierade delvis denna forskning.
Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | — | cell freezing |
cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | — | heating |
Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | — | sterile working bench |
freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | — | sample storage |
Electronic balance MP-300 | Chyo | — | Scale |
BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | — | RFID chip |
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | — | heating |
Heating lamp | Electric Petra, Burgau | — | heating |
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | — | sample organization |
Zebra TLP 2844 printer | Zebra | — | label printer |