Creation and Maintenance of a Living Biobank - How We Do It

Florian B&#252;rtin; Stephanie Matschos; Friedrich Prall; Christina S. Mullins; Mathias Krohn; Michael Linnebacher

doi:10.3791/62065

JoVE Journal > Cancer Research

Pesquisa do Câncer

Criação e Manutenção de um Biobanco Vivo - Como Fazemos

Published: April 10, 2021

doi:

10.3791/62065

Florian Bürtin¹, Stephanie Matschos², Friedrich Prall³, Christina S. Mullins², Mathias Krohn², Michael Linnebacher²

¹Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery,University Medical Center Rostock, University of Rostock, ²Molecular Oncology and Immunotherapy, Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery,University Medical Center Rostock, ³Institute of Pathology,University Medical Center Rostock

Summary

No trabalho a seguir, descrevemos os passos consecutivos necessários para o estabelecimento de um grande biobanco de câncer colorretal e pâncreas.

Abstract

À luz do crescente conhecimento sobre as propriedades inter-individuais e a heterogeneidade dos cânceres, o campo emergente da medicina personalizada requer uma plataforma para pesquisas pré-clínicas. Nos últimos anos, estabelecemos um biobanco de cânceres colorretais e pancreáticos compostos por tecido tumoral primário, tecido normal, soro, linfócitos sanguíneos periféricos isolados (PBL), xenoenxertos derivados do paciente (PDX), bem como linhas de células cancerígenas primárias e secundárias. Como o tecido tumoral original é limitado e a taxa de estabelecimento de linhas primárias de células cancerígenas ainda é relativamente baixa, o PDX permite não apenas a preservação e extensão do biobanco, mas também a geração de linhas de células cancerígenas secundárias. Além disso, os modelos PDX provaram ser o modelo in vivo ideal para testes de drogas pré-clínicos. No entanto, o biobanco requer uma preparação cuidadosa, diretrizes rigorosas e uma infraestrutura bem sintonizada. Colectomia, duodenopancreatectomia ou amostras de metástases resseccionadas são coletadas imediatamente após a ressecção e transferidas para o departamento de patologia. Respeitando a prioridade de um relatório histopatológico imparcial, a critério do patologista assistente que realiza as dissecções, pequenas peças tumorais e tecido não tumoral são colhidos.

Partes necrosas são descartadas e o tecido tumoral restante é cortado em cubos pequenos e idênticos e criopreservados para uso posterior. Além disso, uma pequena parte do tumor é picada e tensa para a cultura primária das células cancerígenas. Além disso, amostras de sangue colhidas do paciente pré e pós-operatório são processadas para obtenção de soro e PBLs. Para o enxerto PDX, os espécimes criopreservados são descongelados e implantados subcutâneamente nos flancos de camundongos imunodeficientes. O PDX resultante recapitula a histologia dos tumores “doadores” e pode ser usado para xenoenxerto subsequente ou criopreservado para uso posterior. No trabalho a seguir, descrevemos as etapas individuais de criação, manutenção e administração de um grande biobanco de câncer colorretal e pâncreas. Além disso, destacamos os detalhes cruciais e ressalvas associados ao biobanco.

Introduction

Nos últimos anos, o conhecimento acumulado das propriedades morfológicas, clínicas e genéticas dos cânceres levou à concepção do câncer como uma doença heterogênea e individual. Consequentemente, a caracterização mutacional das neoplasias, além de características clínicas e patológicas, ganhou importância para a tomada de decisões clínicas e muitas terapias-alvo foram desenvolvidas para diversas alterações moleculares. Por exemplo, a eficácia do cetuximabe no tratamento do câncer colorretal pode ser prevista pela análise do estado mutacional KRAS e PIK3CA ¹. A medicina de precisão visa uma abordagem personalizada para fornecer a maior resposta ao tratamento em cada paciente e evitar a toxicidade de terapias ineficientes². Os biobancos contêm tecidos, sangue e outros materiais biológicos de pacientes com câncer, que estão ligados aos dados clínicos e, portanto, são uma excelente ferramenta para a pesquisa de câncer translacional. Devido ao grande número de amostras clínicas, os biobancos permitem a detecção de mutações raras, mas potencialmente drogáveis, o que proporciona novas oportunidades de tratamento para o paciente individual³.

Para cobrir o mais amplo possível um espectro de pesquisa oncológica, não restringimos nossa atividade apenas na colheita de amostras, mas focamos no estabelecimento de linhas de células cancerígenas derivadas do paciente e xenoenxertos (PDX). As linhas tradicionais de células 2D continuam a ser a pedra de canto da pesquisa in vitro e são a principal escolha para os exames de drogas em larga escala⁴^,⁵. Além disso, a análise da linha celular é muitas vezes mais fácil, mais barata e mais facilmente disponível. Além disso, uma vez que os linfócitos periféricos derivados do paciente (PBL) estão disponíveis, também a imunologia tumoral pode ser estudada in vitro⁶. No entanto, a maioria dos medicamentos recém-desenvolvidos com uma promissora efetividade pré-clínica em experimentos in vitro ou in vivo, têm mostrado resultados decepcionantes em ensaios clínicos⁷. Em contrapartida, estudos pré-clínicos baseados em estudos PDX in vivo têm refletido a atividade clínica de agentes antineoplásicos muito mais fielmente⁸. Uma vez que o tecido PDX reflete de perto as propriedades histológicas e moleculares do tumor doador, os modelos PDX são uma boa maneira de propagar as quantidades muitas vezes muito limitadas de tecido tumoral viável para manter a integridade de um biobanco e permitir a troca de amostras entre grupos de pesquisa e instituições. Além disso, as linhas celulares cancerígenas derivadas do tecido PDX podem ser estabelecidas significativamente mais fáceis do que as linhas primárias de células^{cancerígenas 9}. Nos últimos anos, nosso grupo de trabalho estabeleceu um biobanco integrado integral de câncer colorretal e pâncreas, padronizando e otimizando o fluxo de trabalho para todas as amostras biológicas em questão(Figura 1).

Figura 1: Fluxo de trabalho e organização do biobanco Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

O estudo seguinte foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Centro Médico Universitário Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 e A 2019-0222). Além disso, todos os procedimentos veterinários relevantes foram aprovados pelo Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern sob os números de registro LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 e 7221.3-1-007/19. 1. Pré-requisitos experimentais Conheça várias condições importantes para estabelecer e manter um biobanco. Use uma clínica com departamento cirúrgico e número suficiente de ressecções oncológicas juntamente com um laboratório bem equipado e pessoal acadêmico suficiente. Uma boa infraestrutura e uma ligação firme com um departamento de patologia cooperante são mais pré-requisitos. Para pesquisa in vivo, use um centro animal com condições de moradia adequadas a camundongos imunodeficientes. Obtenha autorização sobre qualquer pesquisa sobre material derivado do paciente de um comitê de ética em saúde. Obtenha aprovação de qualquer pesquisa in vivo da autoridade competente de acordo com as normas estatutárias locais. 2. Coleta de amostras Um dia antes da cirurgia Avalie todos os pacientes com câncer colorretal ou pancreático ressretável e/ou metástases correspondentes para elegibilidade de biobancar. Evite incluir casos com pré-tratamento neoadjuvante, tumores muito pequenos, tumores de dignidade incerta ou lesões que foram parcialmente ressecados endoscopicamente antes. Obter aprovação por escrito da participação do paciente durante a discussão de consentimento informado sobre o procedimento cirúrgico. Informe oportunamente todos os cirurgiões envolvidos, a equipe do laboratório, bem como o patologista. Aquisição de amostras Informe todos os atendentes da sala de operação (OR) sobre a coleta de tecidos para o biobanco imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico.NOTA: É crucial que o tecido não deve ser fixado em formalina. Se o tecido estiver submerso em formalina, torna-se inadequado para biobanco integrado. Desenhe 40 mL de sangue heparinizado (seringa de 2 x 20 mL) bem como um tubo de soro padrão de 7,5 mL imediatamente após a indução anestésico e transfira rapidamente para o laboratório para isolamento de PBL e processamento de soro (ver etapa 3-4). Obtenha a amostra resseccionada diretamente da mesa de operação, coloque-a em um recipiente apropriado e leve-a para o departamento patológico. Anote o ponto de tempo do desprendimento da circulação, ressecção e chegada à patologia.NOTA: A adequação da amostra para biobanco deve ser avaliada pelo patologista cooperante que disseca uma fatia de tumor e tecido não maligno. Não extireta nenhuma parte do espécime por si mesmo que possa comprometer o relatório patológico subsequente. Coloque ambos os pedaços de tecido em um tubo separado de polipropileno de 15 a 50 mL com solução de armazenamento de tecido de 10 a 30 mL (ou DPBS) no gelo. Anote o tempo de recebimento e transfira os espécimes imediatamente para o laboratório.NOTA: As seguintes etapas de protocolo 3-6 devem ser conduzidas em um gabinete de fluxo laminar sob estritas condições estéreis. Use todos os líquidos à temperatura ambiente. 3. Processamento de soro Centrifugar o tubo de soro de 7,5 mL a 1128 x g e 4 °C por 15 min em uma centrífuga pré-resfriada. Aliquot 1 mL soro por tubo em criotubos pré-rotulados e congelamento em nitrogênio líquido. 4. Isolamento do PBL por centrifugação gradiente de densidade NOTA: Trabalhe paralelamente a cada uma das duas seringas de 20 mL. Encha 20 mL de sangue heparinizado em um tubo de polipropileno de 50 mL e adicione 15 mL de DPBS. Tome 15 mL de Pancoll com uma pipeta sorológica, insira a pipeta cuidadosamente até o fundo do tubo de polipropileno e solte o Pancoll muito lentamente para formar uma camada abaixo da coluna sangue/DBPS. Centrifugar a 375 x g por 15 min sem freio. Aspire e transfira a camada interfasa opaca entre a coluna média e superior de ambas as amostras em um tubo de polipropileno fresco de 50 mL e encha com DPBS a 50 mL. Centrífuga a 270 x g por 15 min com freio. Aspire e descarte o supernasce, resuspenque a pelota da célula em 4,5 mL de meio congelador. Aliquot 1,5 mL da suspensão por crioboto, feche os tubos firmemente e coloque-os em um recipiente de congelamento adequado para congelamento lento e armazene a -80 °C. 5. Processamento de tecidos NOTA: Comece com a geração de amostras congeladas de pulmão e tecido saudável para manter a integridade dos ácidos nucleicos. Amostra de tecido tumoral Transfira a amostra tumoral com vários mL de solução de armazenamento de tecido do tubo de polipropileno para uma placa de Petri. Enxágüe com DPBS, se necessário. Evite tocar na amostra e use dois bisturis estéreis para manusear o tecido. Evite a proficação a qualquer momento. Pesar a amostra do tumor em uma escala conveniente em um prato separado e observar o peso do tecido. Avalie a qualidade do tamanho, forma e tecido do tecido tumoral antes de cortar. Procure obter pelo menos uma peça do tamanho de uma cabeça de alfinete para congelamento de encaixe e quatro cubos de aproximadamente 30 mm3 (comprimento da borda 3 x 3x 3 mm) cada um para criopreservação vital. Gere o máximo possível de 30 mm3 cubos em quádruplos e gere uma peça para congelamento por 5 quádruplos. Leve também em conta que as porções necrosadas devem ser cortadas para que os cubos consistam apenas em tecido vital. Gerar fatias de 3 mm de espessura. Corte as porções necróticas, distinguíveis como massa líquida ou gel, e corte as fatias em cubos dos dois tamanhos desejados.NOTA: Não descarte nenhum tecido neste momento. Congelamento de snap Rotule criotutos em conformidade (ver passo 7.7). Coloque uma pequena peça de tecido por criotube pré-rotulado. Submergir as amostras imediatamente em nitrogênio líquido por vários minutos e armazenar a -80 °C posteriormente. Criopreservação de tecido vital Rotule os criotubos em conformidade (ver passo 7.7) e encha cada um com 1,5 mL de meio congelador. Coloque o recipiente de congelamento ao lado do banco.NOTA: Siga os próximos passos o mais rápido possível. Como o DMSO no meio congelador possui propriedades citotóxicas, o tempo do tecido ser submerso em meio congelador sem resfriamento adequado não deve exceder 2 minutos. Disponha os cubosde 30 mm 3 em quádruplos. Empurre tecido necrosado e outros restos até a borda do prato, mas não os descarte. Colher os cubos com a lâmina do bisturi e transferir 4 cubos por crioboto. Certifique-se de que as peças tumorais estão totalmente submersas no meio congelador. Feche os tubos firmemente e coloque-os em um recipiente de congelamento adequado para congelamento lento e armazene em um congelador de -80 °C. Transfira criotus para um sistema de armazenamento adequado para armazenamento a longo prazo a -140 °C ou inferior. A documentação no sistema de gestão de estoques laboratoriais é obrigatória. Amostra de tecido saudável: Repetir etapas 5.1.1. a 5.1.6.4 para a amostra de tecido saudável. 6. Cultura celular primária Desintegrem os restos do tecido tumoral, incluindo a sucata necrosa, na placa de Petri com os bisturis em pedaços o menor possível. Coloque um coador de células estéreis (tamanho de poros de 100 μm) em cima de um tubo de polipropileno de 50 mL. Use uma pipeta sorológica para adicionar 5-10 mL de DPBS à placa de Petri, flutuar os restos de tecido e pipeta para cima e para baixo para gerar uma suspensão. Transfira a suspensão com a pipeta para o coador de células. Repita as etapas 6.3-6.4 até que todos os restos de tecido sejam resolvidos a partir da placa de Petri. Use o êmbolo de uma seringa unidireção de 20 mL para espremer a suspensão celular e tecidual através do coador celular. Enxágüe com 5-10 mL de DPBS fresco, descarte o coador celular e feche o tubo corretamente. Centrifugar a suspensão a 180 x g por 5-10 minutos. Prepare uma placa de 6 poços com 1,5 mL de média por poço. Aspire e descarte o supernaspe. Resuspenda a pelota em 3 mL de DPBS ou médio e adicione 500 μL da suspensão a cada poço. Coloque a placa na incubadora (100% de umidade, 5% DE CO2, 37 °C) Monitore a placa diariamente para crescimento celular e contaminação.NOTA: Mais células que culminam até o ponto de estabelecimento de uma linha celular permanente não é descrita aqui. 7. Geração PDX Realizar experimentosi n vivo apenas por pessoas devidamente qualificadas atendendo aos requisitos da autoridade competente de sua jurisdição. Abrigar camundongos imunodeficentes em condições específicas livres de patógenos (SPF) satisfazendo as demandas da cepa de camundongos usados. As medidas higiênicas incluem gaiolas ventiladas individualmente, alimentos autoclavados, água e material de aninhamento, bem como uma trava de ar de segurança e o uso de equipamentos de proteção pessoal. Autoclave todos os instrumentos com antecedência e use apenas um conjunto de instrumentos para cada caso de tumor para evitar contaminação cruzada. Manuseie o tecido tumoral o mais asséptico possível. Todos os itens plásticos nomeados abaixo devem ser estéreis, de uso único e descartados após cada cirurgia.NOTA: Determinada pelo método de congelamento de quatro pedaços de tecido tumoral por crioboto, a geração PDX requer sempre dois camundongos por amostra, resultando idealmente em quatro tumores PDX. Escolha o tumor primário desejado para enxerto através do sistema de gerenciamento de inventário de laboratório e transfira a amostra (tecido tumoral vitalmente preservado) do tanque de armazenamento principal para um recipiente de nitrogênio líquido portátil (armazenamento intermediário a -80 °C em gelo seco também é conveniente). Coloque equipamentos de proteção individual antes de entrar na seção SPF (esfregões, tamancos, avental, tampa de cabelo, máscara cirúrgica e sobresaltos), desinfete as mãos e todos os equipamentos. Imersão de matrigel Remova o criobotube formando o recipiente de nitrogênio líquido e aguarde o descongelamento da amostra. Rotule um tubo de polipropileno de 50 mL e encha com 35 mL de DPBS. Incline o crioboia para cima e para baixo e transfira o conteúdo imediatamente para o tubo de polipropileno assim que o tecido-médio-lama puder ser deslocado. Enxágue suavemente os pedaços do tecido tumoral, descarte o volume principal do tubo em um vaso separado, feche a tampa e coloque o tubo de lado para baixo, de modo que as quatro peças de tecido se reúnam na tampa. Coloque uma placa de Petri no acumulador de resfriamento e coloque 100 μL de Matrigel como uma única gota no meio. Use fórceps anatômicos para transferir os pedaços do tumor para o Matrigel. Certifique-se de que cada peça está completamente coberta com Matrigel. Incubar por 10 minutos a 4 °C. Anestesia do rato (2 ratos por amostra, trabalhe em paralelo) Prepare uma solução anestéstica de 3:1- de cetamina (100 mg/mL) e xilazina (20 mg/mL). A dose recomendada é 90/6 mg/kg de peso corporal. Pese o rato e elasenhe a solução anestésico necessária em uma única seringa de insulina de uso único. Coloque o mouse na grade da gaiola, puxe sua cauda suavemente com uma mão para induzir um movimento para a frente e, simultaneamente, caranguejo o pescoço com uma pitada de aperto da outra mão. Levante o rato da grade e gire a mão de segurando, para que as costas do animal repousem sobre sua palma. Imobilize uma das patas traseiras com seu mindinho e injete os narcóticos intraperitoneally. Coloque o rato de volta em sua gaiola e aguarde indução de narcóticos. Coloque o rato anestesiado na placa de aquecimento e cubra os olhos com pomada para evitar danos na córnea. Aça a profundidade da anestesia beliscando suavemente o pé traseiro do rato com fórceps cirúrgicos.NOTA: A ausência de movimento indica narcose profunda. Qualquer tipo de movimento requer mais tempo para atingir a profundidade do narcótico desejado ou uma dose adicional de anestésicos. Procedimento cirúrgico Forme uma dobra de pele beliscando o pescoço do mouse e injete o microchip subcutâneamente com o aplicador (Veja o passo 9 para detalhes de programação) Raspe os flancos do mouse se necessário (ratos NMRInu/nu não precisam de barbear), aplique povidone-iodo com um cotonete e use cortina cirúrgica para criar um campo estéril. Levante a pele do flanco com fórceps cirúrgicos, faça uma pequena incisão de cerca de 4 mm e forme um pequeno bolso subcutâneo por preparação contundente com tesoura. Coloque uma peça de tumor em cada bolso e coloque-a na parte traseira. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 100 μL e aspire o Matrigel restante da placa de Petri e aplique-a igualmente em cada bolso de pele. Feche as feridas com suturas simples interrompidas e aplique molho spray. Escaneie o microchip e verifique a validade do mouse e do tumor-ID. Prepare uma nova gaiola com roupa de cama fresca e material de aninhamento, bem como uma vara de roer. Dobre uma “almofada” de toalhas de papel e deite o mouse com cabeça elevada sob uma lâmpada de calor infravermelha. Misture 0,25 mL de trimetoprim/sulfametoxazol (400 mg/80 mg) com 100 mL de água potável e administre através da garrafa de beber. Considere que um rato consome aproximadamente 150 mL por kg de peso corporal diariamente.NOTA: Como o modelo PDX subcutâneo não está associado à dor pós-operatória, nem durante o processo de cicatrização da ferida, nem durante o crescimento do tumor, não é necessária analgesia pós-operatória. Por favor, note que as diretrizes de bem-estar animal de sua instituição/autoridade podem diferir. Monitoramento de animais experimentais Monitore os ratos diariamente em busca de sinais de angústia. Isso pode ser delegado a cuidadores qualificados de animais. Mantenha o tratamento antibigoreto pós-operatório com a dosagem acima mencionada por 4 semanas. Substitua a mistura de antibióticos duas vezes por semana. Meça o tamanho do tumor pelo menos uma vez por semana, idealmente diariamente, com uma pinça (volume de tumor = 0,52 x comprimento x largura x altura [mm3]) e registo no banco de dados. 8. PDX colheita e processamento Colher e processar o tumor PDX, quando:O tamanho do tumor atinge o volume alvo de 1.500 mm3.O tumor que leva animal apresenta sinais de angústia e/ou doença e o tratamento é inútil.O tumor fica ulcerado ou penetra na pele do camundongo. Leia o microchip para identificar o PDX correto. Eutanize o camundongo por um método legal (dependendo das diretrizes nacionais) como por exemplo co2-asfixia ou injeção de cetamina/xilazina seguida de luxação cervical. Levante a pele com fórceps cirúrgicos nos flancos e incise com a tesoura Metzenbaum a alguns milímetros de distância do tumor. Retire a pele acima do tumor por preparação sem cortes, em seguida, segure cuidadosamente o tumor com fórceps anatômicos e desprende o tumor da fáscia superficial do corpo. Enxágüe o tumor com DPBS, coloque-o em uma placa de Petri e remova o tecido conjuntivo adjacente. Neste ponto, realize um dos seguintes: Corte 30 mm3 cubos e crie novo PDX (Proceda com protocolo no ponto 7.7.4). Corte o tumor em fatias, que são então transferidas para de histologia e preservadas em 4% de formaldeído para incorporação posterior de parafina. Preservar o tumor em um tubo com solução de armazenamento de tecidos para adicioná-lo ao biobanco (Proceder com o protocolo na etapa 3.) e/ou criar linhas celulares derivadas do PDX (Proceder com protocolo na etapa 4.) 9. Biobank e gestão de dados Atribua uma identidade interna a cada caso de tumor de acordo com a Tabela 1. Localização/nome do laboratório entidade do câncer número de caso consecutivo especificação número consecutivo C=colorretal _Met=Metástase P=pâncreas _Tu=Tumor Exemplo: HROC389_Met2 = Rostock, câncer colorretal, caso 389, segunda metástase Tabela 1: Definição do ID da amostra. Armazene o consentimento do paciente em formulário eletrônico e em papel juntamente com o tumor-ID. Reúna o máximo de dados clínicos possíveis e armazene-os anonimizados e separadamente. Use um software de gerenciamento de dados (por exemplo, Freezerworks) ou outro e crie uma interface com um software de impressão de etiquetas para gerar etiquetas de código de barras resistentes à temperatura e auto-grudante. Adicione uma nova amostra abrindo o software de gerenciamento de dados, defina o tipo de amostra e regise as seguintes informações: ID do tumor, tipo de tecido, método de congelamento, data, funcionário responsável, número de passagem, identificação do mouse e cepa do mouse. Atribua as amostras a posições específicas no tanque de armazenamento. Rastreamento e monitoramento do PDX (Aplica-se à etapa 7-8) Use uma base de dados ms access (ou um sistema semelhante) em um dispositivo portátil habilitado para Bluetooth (laptop ou tablet) para registrar iD tumoral, data de implantação, data de eutanásia, idade e tensão do mouse, bem como crescimento de tumor ao longo do tempo. Conecte o leitor de microchip ao dispositivo e leia o microchip antes da implantação. Atribuir um ID específico a cada mouse; usamos o seguinte esquema:(ver Tabela 2 abaixo) Após a implantação, registo o ID juntamente com as características do mouse na base de dados. Leia novamente o microchip e verifique se as especificações do microchip, da base de dados e do rótulo criotube são consistentes. Crie um rótulo para cada gaiola de mouse de acordo.NOTA: Para criar um backup físico, coloque as etiquetas criotube com as etiquetas de microchip correspondentes em um livreto e nota data e tensão do mouse. Para monitorar o crescimento tumoral do PDX individual, escaneie o microchip do mouse com o leitor conectado ao dispositivo de base de dados para identificação e registro do tamanho do tumor medido por pinça a cada semana. Planeje o ponto de tempo ideal da colheita do PDX analisando a curva de crescimento do tumor. ID tumoral Armazenamento prévio em N2 (=f) Número de passagem (=T) número de mouse consecutivo (=M) Exemplo: HROP12 fT0 M1 = Rostock, câncer de pâncreas, caixa 12, gerado a partir de tecido primário congelado, primeira passagem, rato 1. Tabela 2: Definição do ID PDX.

Representative Results

Em nossas mãos, a taxa de estabelecimento de culturas celulares primárias (Figura 2A & B) foi de 12,9% em uma grande série9. A maioria das tentativas de isolar células tumorais expansíveis de amostras resseccionadas cirúrgicas recentes falhou devido à falta de crescimento ou contaminação precoce. O estabelecimento de linha celular foi considerado bem-sucedido após 3 passagens com crescimento constante em condições de cultura padrão (DMEM, 10% FCS, navio de cultura padrão) e validação da diferenciação epitelial via FACS-analysis10. As linhas celulares derivadas dos tumores PDX (Figura 2C & D) apresentaram maior taxa de estabelecimento de 23,6%, o que também se deve à possibilidade de tentativas repetitivas em contraste com os tumores primários ressecados9. No entanto, algumas culturas mistas (Figura 2E) não podem ser livres do crescimento fibroblástico ou mesmo são perdidas devido ao crescimento fibroblástico(Figura 2F). Figura 2: Cultura celular. Linhas primárias de células cancerígenas, derivadas de uma metástase do caso de câncer de cólon HROC313, passagem 21 (A) e caso de câncer de pâncreas HROP88, passagem 5 (B). Linhas cancerígenas derivadas do PDX do PDX HROC285 T0 M2 (D) e do pâncreas PDX HROP10 T5 M2, passagem 4 (E). Cultura mista de fibroblastos e células cancerígenas do câncer de pâncreas HROP75, passagem 8 (C) e crescimento excessivo fibroblástico (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Considerando mudanças no protocolo de geração de PDX, cepas de camundongos usadas e também experimentadores ao longo de vários anos, bem como grandes diferenças na quantidade de tecido tumoral disponível para enxercimento, não é trivial dar a taxa de sucesso global da geração PDX. Em uma série muito recente de experimentos de geração PDX realizados por dois pesquisadores (S.M. e F.B.), foram observadas taxas primárias de crescimento de 63% para PDX colorretal (uma histologia exemplar que pode ser retratada a partir da Figura 3A) e 48% para pdx pancreático (Figura 3B). O crescimento de linfomas murinos ou humanos no local da implantação é relativamente raro, mas pode imitar o crescimento bem sucedido do PDX(Figura 3C). Além do exame histopatológico, a concordância entre os modelos PDX e seus pacientes doadores foi regularmente confirmada pela análise de repetição de tandem curto (STR)(Figura 3D). Até os dias atuais, o biobanco compreende >50 modelos colorretal primário e >50 secundários, 3 linhas primárias e 6 de células cancerígenas pancreáticas secundárias, bem como >150 modelos PDX colorático e 19 pancreáticos. Figura 3: Comparação histológica representativa do colorretal (A) e do PDX pancreático (B). Linfoma humano no local de implantação imitando o crescimento do PDX (C). Teste de identidade genética de um modelo PDX (HROC430 T1 M2) para o tecido tumoral do paciente original (HROC430Tu) por análise de repetição de tandem curto (STR). Comparação dos nove STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (corante FAM) e D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (corante HEX) usando MULTIPLEX PCR com primers fluorescentes rotulados após a eletroforese capilar confirmou concordância genética do PDX e tumor de doadores (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A geração de um biobanco vivo pressupõe, além de cumprir as normas legais de privacidade, direito médico e bem-estar animal, uma boa infraestrutura e uma equipe bem coordenada. Tem se mostrado vantajoso envolver diretamente uma parte da equipe cirúrgica nos procedimentos de pesquisa, uma vez que eles podem avaliar muito bem a adequação do paciente individual para a doação de tecidos. Além disso, os pacientes tendem a consentir com o biobanco com mais frequência, quando sua aprovação por escrito é obtida no curso da discussão de consentimento informado cirúrgico. Para economizar tempo e recursos, casos que presumivelmente produzirão quantidades insuficientes de tecido tumoral não devem ser selecionados para biobancar. Quando se trata de aquisição de espécimes, a máxima “comunicação é fundamental” é uma verdade simples, mas muitas vezes negligenciada. Basta uma única enfermeira de teatro não informada ou colega cirúrgico para arruinar o espécime logo no início, procedendo como de costume e adicionando formaldeído ao espécime de ressecção. Portanto, é absolutamente crucial que cada membro da equipe envolvida se familiarize com o SOP para biobancar. Os cirurgiões devem ser notados no dia anterior e logo no início do procedimento sobre a coleta programada de tecidos. Além disso, os casos selecionados para biobancarização devem ser destacados no plano or eletrônico. A colheita de tecidos da amostra cirúrgica deve ser realizada por um patologista. Em primeiro lugar, isso garantirá que a colheita de tecidos não interfira no relatório patológico final. Em segundo lugar, isso aumenta a probabilidade de receber tecido com quantidades adequadas de tecido cancerígeno viável. Especialmente em cânceres pancreáticos com uma reação desmoplástica pronunciada e áreas necrosadas frequentes, partes viáveis são difíceis de identificar macroscopicamente para o olho destreinado. Como exceção a esta regra, os blocos teciduais de grandes metástases hepáticas ou pulmonais, podem, por vezes, ser extirpados “back-table” pelo cirurgião, se as margens cirúrgicas podem ser definidas macroscopicamente. O câncer retal ressecado pela excisão mesorectal total (TME), pode não ser adequado para biobancar, uma vez que a colheita de tecidos da amostra resseced antes da incorporação da parafina pode interferir na avaliação da qualidade do TME. Alternativamente, o tecido para biobancarina pode ser adquirido por biópsia transanal de câncer retal.

As taxas de estabelecimento para culturas celulares primárias derivadas do tumor original são geralmente baixas. Culturas de células secundárias derivadas do PDX podem ser mais provavelmente estabelecidas com sucesso. Recomendamos o teste de diferentes mídias para cada caso e o uso de suplementos antibióticos para as primeiras passagens para reduzir a contaminação ao mínimo, uma vez que o tecido colhido raramente é estéril. Após a propagação bem sucedida, cada linha celular individual deve ser confirmada como uma linha celular cancerosa pela análise FACS e regularmente testada para contaminação por micoplasma. Para excluir a contaminação cruzada, é aconselhável a análise regular de STR. Deve-se notar que o protocolo de estabelecimento para linhas de células primárias e secundárias está constantemente sujeito à otimização. Os detalhes sobre a composição e as taxas de sucesso da mídia única estão claramente além do escopo deste trabalho e serão publicados separadamente.

Para o enxerto PDX, o tecido tumoral pode ser implantado diretamente após a ressecção ou criopreservado no soro de bezerro fetal com 10% de DMSO ou mídia de congelamento similar para implantação retardada. A implantação imediatamente após a colheita de tecido tumoral coloca uma pressão sobre a logística e a equipe de laboratório, e os resultados de xenoenxerto após a criopreservação não são inferiores em todos os ¹⁰. Além disso, a incubação do tecido em Matrigel antes da implantação do tumor, aumenta significativamente as taxas de enenxerção¹². Recomendamos o enxerto atrasado após o achado patológico definitivo e o descarte imediato de amostras de tecido coletadas erroneamente. Uma vez que a taxa de sucesso do enenerxamento primário aumenta com a imunodeficiência do mouse receptor, tendemos a usar ratos NSG para a primeira passagem PDX. Após o primeiro enxerto PDX bem sucedido, os ratos^{nMRI nu/nu}podem e devem ser usados para passagens subsequentes e expansão tecidual. Esta cepa é mais robusta, mais barata e mais fácil de procriar em comparação com nsg ou cepas imunodeficientes semelhantes, mas ainda mostra taxas razoáveis de enenxerção. Além disso, sua nudez facilita a implantação e o monitoramento do crescimento do tumor. Para aumentar as taxas de engraftment em passagens subsequentes, recomendamos a transferência direta de tecidos PDX recém-colhidos para camundongos de hospedagem sempre que possível, especialmente para PDX de crescimento lento e casos com baixa taxa de sucesso de engrafamento primário. Collins e Lang revisaram recentemente 14 estudos do estabelecimento colorretal de PDX e relataram taxas de engraftment variando de 14 a 100% com uma taxa mediana de estabelecimento PDX de 68%, sendo este último consistente com nossos achados¹³. Em consonância com a literatura, observamos taxas de estabelecimento mais baixas de pâncreas em comparação com o câncer colorretal PDX¹⁴. Independentemente da variedade de camundongos hospedeiros e da entidade tumoral, o crescimento do vírus humano, linfomas de células B associados ao Epstein-Barr (EBV) e linfomas murinas no lado da implantação representa uma importante armadilha^15,¹⁶. Se não forem reconhecidos, tais tumores podem “contaminar” passagens subsequentes e, assim, confundir resultados consecutivos. O crescimento rápido incomum do PDX e o inchaço dos linfonodos cervicais, axilares e inguinais são fortes indicadores de crescimento de linfoma murino, mas o exame histológico regular do PDX é, no entanto, aconselhável. Além disso, a concordância genética entre pdx e o paciente doador correspondente deve ser testada regularmente pela análise str. Idealmente, o biobanco deve estar vinculado a um banco de dados clínico composto por características dos pacientes (informação geral, sobrevivência, sobrevida livre de recaídas, terapia, neoplasia secundária etc.). Devido às regulamentações legais de proteção à privacidade e à falta de uma base de dados anonimizada, nosso conjunto de dados clínicos é regularmente administrado e atualizado manualmente pelos médicos que cooperam.

Enquanto os biobancos convencionais estão limitados à pesquisa do observatório, um biobanco vivo oferece a oportunidade para intervenções in vitro e in vivo. As linhas celulares derivadas do paciente são uma ferramenta importante para pesquisas fundamentais, triagens de medicamentos de alto rendimento e avaliação de novos agentes farmacêuticos⁴. Os modelos PDX correspondentes, no entanto, são de importância crescente, uma vez que recapitulam de perto a histologia do tumor original¹⁷^,¹⁸ e mostram alta estabilidade genética ao longo de várias passagens¹⁹^,²⁰. Nosso biobanco PDX provou-se como uma excelente plataforma para pesquisas pré-científicas e fundamentais^6,²¹. Além disso, uma vez que grandes coleções de PDX refletem adequadamente a heterogeneidade inter-individual da população paciente, a abordagem do ensaio clínico PDX (PCT) (um animal por modelo por tratamento) ganhou importância para o desenvolvimento de medicamentos, uma vez que permite a previsão fiel da resposta clínica a novos medicamentos e ao regime combinatório⁸. Também estamos avaliando novas drogas experimentais em pequenos testes de PCT.

Apesar desses resultados promissores, a duração mediana do estabelecimento de 12,2 meses, impede a aplicabilidade clínica dos modelos PDX como “camundongos avatares” para testar opções de tratamento anticancerígeno, pelo menos para aqueles pacientes que necessitam de tratamento adjuvante imediato ou mesmo neoadjuvante²². Uma desvantagem adicional dos modelos PDX padrão é a falta de usabilidade para testes de imunoterapia devido à imunodeficiência dos camundongos hospedeiros. Para superar essas limitações, várias cepas de camundongos “humanizadas” foram desenvolvidas. Estes camundongos são fortemente imunocomprometidos, mas podem ser reconstituídos com vários tipos de células derivadas da medula óssea humana ou células-tronco hematopoiéticas após o crescimento do PDX²³, permitindo a avaliação da citotoxicidade mediada pela linfócito e da resposta terapêutica ao tratamento inibidor de ponto de verificação imunológico²⁴^,²⁵.

Nos últimos anos, organoides derivados do paciente (PDO) surgiram como importantes modelos de câncer competindo com pdx. Derivadas de pedaços tumorais intactos e cultivadas em um andaime de matriz extracelular, essas estruturas tridimensionais refletem de perto as propriedades histológicas e genéticas do tumor original. A possibilidade de expansão e criopreservação a longo prazo torna o PDO um suplemento ideal de um biobanco vivo²⁶^,²⁷. Além de uma taxa de estabelecimento relativamente alta, a previsão de resposta confiável a medicamentos foi relatada para PDO de várias entidades tumorais²⁸. Além disso, os PDOs têm sido gerados a partir de células tumorais circulantes e também o estabelecimento simultâneo de organoides a partir de tecido sadio correspondente é possível, permitindo a avaliação da toxicidade relacionada à terapia em uma base paciente-individual²⁹^,³⁰. No entanto, em comparação com as culturas convencionais de células 2D, a cultura organoide é o consumo de tempo e os compostos de matriz extracelular artificial podem interferir em certos procedimentos analíticos³¹. Além disso, os organoides cancerígenos são suscetíveis ao crescimento excessivo por organoides não malignos de crescimento mais rápido derivados do epitélio^{saudável 30}. Devido à falta de estroma, vasos sanguíneos e células imunes, os PDOs são em sua maioria inaplicáveis para o teste de agentes imunoterapêuticos antiangiogênicos. No entanto, novos métodos de cultivo permitem a modelagem do microambiente tumoral in vitro,tornando os PDOs um verdadeiro concorrente para os modelos PDX³². Em um futuro próximo, modelos de tumores individuais do paciente, combinados com poderosas ferramentas genéticas como o sequenciamento da próxima geração, esperançosamente abrirão o caminho para a verdadeira medicina de precisão e abordagens de tratamento sob medida.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós gentilmente reconhecemos Jenny Burmeister, nossa assistente gráfica, para a gravação e edição do vídeo. Além disso, agradecemos aos nossos colegas do departamento cirúrgico e patológico pela colaboração de longa data. Agradecemos também a Marcus Müller, gerente de produção do Centro de TI e Mídia da Universidade de Rostock, pelo fornecimento do equipamento de gravação de áudio e pelo refino da qualidade do som.

FINANCIAMENTO: A Fundação Alemã de Auxílio ao Câncer (DKH e.V.), o número de subvenção 108446, e o número de subvenção TBI-V-1-241-VBW-084 do estado Mecklenburg-Vorpommern financiaram parcialmente esta pesquisa.

Materials

Bacillol® AF; 1L	Bode, Hartmann	REF 973380	desinfection
PP centrifuge tube, 15ml; sterile	Greiner Bio One	GBO Cat. No.:188271	centrifuge tube
PP centrifuge tube, 50ml, sterile	Sarstedt	Order number: 62.547.254	centrifuge tube
BD Discardit^TMII Syringe 20ml	BD	REF 300296	blood collection
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette	Sarstedt	Item number: 01.1601	blood collection
serological Pipette 10ml	Sarstedt	REF 86.1254.001	liquid transfer
Pipetboy ratiolab® accupetta	Ratiolab	Item number: RL3200300	liquid transfer
PIPETBOY acu 2	Integra Biosciences	VWR Cat.No: 613-4438	liquid transfer
DPBS; w/o Ca & Mg	Pan Biotech	Cat. No.: P04-36500	washing
Pancoll human	Pan Biotech	Cat. No.: P04-60500	density gradient centrifugation
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	PAN Biotech	Cat. No.: P04-41500	cell cultivation
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum)	PAN Biotech	Cat. No.: P40-47500	cell cultivation
L-Glutamine 200mM	PAN Biotech	Cat. No.: P04-80100	cell cultivation
Trypsin / EDTA	PAN Biotech	Cat. No.: P10-023100	cell cultivation
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)	PanReac AppliChem	VWR Cat.No: A3672.0250	cell freezing
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO)	selfmade	—	cell freezing
cryotube- CryoPure 2ml	Sarstedt	72380	cell freezing
6-Well cell culture plate; steril; with lid	Greiner bio-one	Cat.-No.: 657 160	cell cultivation
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams	Sarstedt	Cat. No.: 82.1472.001	tissue preparation
sterile surgical blades	B.Braun (Aesculap)	REF BB510	tissue preparation
BD Discardit^TMII Syringe 10ml	BD	REF 309110	tissue preparation
cell strainer; yellow; 100µm	Falcon	REF 352360	tissue preparation
CoolCell	biocision	Item number: 210004	cooling container with -1°C/min
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm	KGW	Cat. No.: HT39.1	transport system
Pipette tip 200µl	Sarstedt	REF 70.760.002	liquid transfer
Filter tip 1000µl	Sarstedt	REF 70.762.411	liquid transfer
Pipette 200µl, yellow	Eppendorf	Cat. No.: 3121 000.082	liquid transfer
Pipette 1000µl, blue	Eppendorf	Cat. No.: 3121 000.120	liquid transfer
incubator BB 6220 CU	Heraeus	Cat.-No.: 51012839	cell cultivation
heating plate PRÄZITHERM	Harry Gestigkeit GmbH	—	heating
Microscope Zeiss Primo Vert	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	Serial number. 3842000839	imaging cell cultures
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc	nunc GmbH & Co. KG	—	sterile working bench
freezer -80°C	Kryotec-Kryosafe GmbH	—	sample storage
Electronic balance MP-300	Chyo	—	Scale
BD Micro-fine, U100 insulin syringe	BD	REF 324826	injection anesthetic
Rompun 2%; 25ml	Bayer	approval number: 6293841.00.00	anesthesia
Ketamin 100 mg/ml, 25ml	CP-Pharma GmbH	approval number: 401650.00.00	anesthesia
GES3S Reader	Datamars	not available	RFID reader
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm)	Peddymark	—	RFID chip
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml	Ratiopharm	PZN-03928197	antibiotic drinking water
Heating plate #FM-20 42x28cm	Dragon	—	heating
Heating lamp	Electric Petra, Burgau	—	heating
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen	Bayer	PZN-01578675	Eye protection
anatomical tweezer	B.Braun Aesculap	BD21 OR	surgical instruments
surgical tweezer	B.Braun Aesculap	BD50 1 R	surgical instruments
scissors	B.Braun Aesculap	BC05 6R	surgical instruments
needle holder	B.Braun Aesculap	BH1 1 OR	surgical instruments
Prolene 5-0	Ethicon	XN8870.P32	surgical suture material
Opsite moisture vapour permable spray dressing	Smith&Nephew	REF 66004978, PZN- 02063507	surgical suture material
Adhesive aperture drape	Barrier	REF 904622	sterile OP tissue
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm	Lohmann&Rauscher	REF 18506	sterile OP tissue
Raucotupf cotton tipped applicators	Lohmann&Rauscher	REF 11969	applicator
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	Cat.-No.: 354234	Basement Membrane Matrix
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine)	B.Braun Melsungen AG	Item number: 18839	desinfection
MACS® Tissue Storage Solution	Miltenyi Biotec GmbH	Order No.:130-100-008	storage solution
Formafix 4%	Grimm med. Logistik GmbH	Item number: F10010G	fixation solution
Software FreezerworksBasic	Dataworks Development, Inc	—	sample organization
Zebra TLP 2844 printer	Zebra	—	label printer

Referências

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Citar este artigo

Bürtin, F., Matschos, S., Prall, F., Mullins, C. S., Krohn, M., Linnebacher, M. Creation and Maintenance of a Living Biobank – How We Do It. J. Vis. Exp. (170), e62065, doi:10.3791/62065 (2021).