Selüloz, hem birincil hem de ikincil hücre duvarlarında bulunan hücre duvarlarının birincil yük taşıyan bileşenidir. Hücre duvarı, bitki hücrelerini çevreleyen hücre dışı bir matristir ve öncelikle selüloz, lignin, hemiselüloz, pektin ve matris proteinlerinden oluşur. Bitki biyokütlesinin yaklaşık üçte biri selüloz^1’dir ve güç, sertlik, hücre büyüme hızı ve yönü, hücre şekli bakımı ve biyotik ve abiyotik stresörlerden korunma sağlayarak bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli roller oynar. Pamuk lifi% 95 selüloz² içeriği içerirken, ağaçlar bitki türlerine ve organ türlerine bağlı olarak selülozun% 40 ila% 50’sini içerir³. Selüloz, β-1,4 glikosidik bağ⁴ile birbirine bağlanan glikoz kalıntılarının bir disakkarit olan tekrarlayan selobioz ünitelerinden oluşur. Selülozik etanol bitki hücre duvarlarında bulunan selülozdan elde edilen glikozdan üretilir⁵. Selülozik lif, her mikro fibril’in 500-15000 glikoz monomerleri^1,6ile çekirdek birim olarak hareket ettiği birkaç mikro fibrilden oluşur. Selüloz homopolimer plazma membran gömülü selüloz synthase kompleksleri (CSC’ler)^1,7ile sentezlenmiştir. Bireysel selüloz synthase A (CESA) proteinleri glukan zincirlerini sentezler ve bitişik glukan zincirleri hidrojen bağları ile bağlanarak kristal selüloz^{oluşturur 1,8}. Selüloz, iki baskın formla çeşitli kristal formlarda bulunur, selüloz Iα ve selüloz Iβ yerel formlar olarak⁹. Daha yüksek bitkilerde selüloz Iβ formunda selüloz bulunurken, daha düşük bitki selülozu Iα formunda^{bulunur 10,11}. Genel olarak, selüloz bitki hücre duvarlarına güç ve sertlik vermede önemli bir rol oynar.

Birinci nesil biyoyakıtlar öncelikle gıda kaynakları olan mısır nişastası, kamış şekerleri ve pancar şekerlerinden üretilirken, ikinci nesil biyoyakıtlar gıda dışı bitki biyokütle hücre duvar malzemesinden biyoyakıt üretimine odaklanmaktadır¹². Kristal selüloz içeriğinin doğru tahmini sadece selüloz biyosentezi ve hücre duvarı dinamikleri üzerine temel araştırmalar için değil, aynı zamanda uygulamalı biyoyakıt ve biyo ürünler araştırmaları için de önemlidir. Bitki biyokütlesinde selülozun tahmini için çeşitli yöntemler geliştirilmiş ve optimize edilmiştir ve Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Selüloz tahmini için bildirilen ilk yöntem 1908’de Cross ve Bevan tarafından¹³. Yöntem, sodyum sülfat ile alternatif klorlama ve ekstraksiyon prensibine dayanıyordu. Bununla birlikte, Cross ve Bevan yönteminin orijinal ve değiştirilmiş protokolleri tarafından elde edilen selüloz, önemli miktarda kslan ve mannans^14’eek olarak lignin küçük fraksiyonlarının kirlenmesini gösterdi. Lignin ve hemiselülozları selüloz fraksiyonundan çıkarmak için yapılan çeşitli değişikliklere rağmen, Cross-Bevan yöntemi selülozla birlikte önemli miktarda mannan tuttu. Daha sonra Kurschner’in yöntemi selüloz çıkarmak için nitrik asit ve etanol kullanarak geliştirilmiştir¹⁵. Bu yöntemde total lignin ve pentosanların %75’inin çıkarıldığı ancak gerçek selüloz sonuçlarının Cross ve Bevan klorlama yöntemi ile tahmin edilenlerle aynı olduğu belirtilmiştir. Başka bir yöntem (Norman ve Jenkins) selüloz çıkarmak için metanol-benzen, sodyum sülfat ve sodyum hipoklorit kullanarak geliştirilmiştir¹⁶. Bu yöntem ayrıca lignin bazı fraksiyonunu da korudu (%3) ve selülozun doğru tahmin edilmesine yol açan önemli miktarda pentosan. Daha sonra, Kiesel ve Semiganowsky% 80 konsantre sülfürik asit kullanarak selülozu hidrolize etmek için farklı bir yaklaşım kullandılar ve hidrolizlenmiş azaltılmış şekerler Bertrand’ın yöntemi ile tahmin edildi¹⁷. Kiesel ve Semiganowsky’nin yöntemine dayanarak geliştirilen Waksman’s ve Stevens¹⁸ve Salo 14 ^,19 olmak üzere iki yöntem, önceki yöntemlere kıyasla % 4-5 daha az selüloz içeriği sağladı²⁰.

Updegraff yöntemi, kristal selüloz içeriğinin tahmin edilmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu yöntem ilk olarak Updegraff tarafından 1969 yılında selüloz ölçümü için^{tanımlanmıştır 21}. Updegraff yöntemi Kurschner yöntemini (nitrik asit kullanımı), Kiesel ve Seminowsky yöntemlerini (selülozun sülfürik asit kullanarak glikoz monomerlerine hidrolizi) ve glikoz ve kristal selüloz içeriğinin basit kolorimetrik tahmini için Viles ve Silverman’ın antroni tahlilini entegre eder²². Bu yöntemin prensibi, daha fazla işleme ve tahmin için asetik/nitrik aside dirençli selüloz bırakan homojen bitki dokularından hemiselüloz ve lignin ortadan kaldırmak için asetik asit ve nitrik asit (Updegraff reaktifi) kullanılmasıdır¹⁵. Asetik/nitrik aside dirençli selüloz, selülozu glikoz monomerlerine kırmak için% 67 sülfürik asit ile tedavi edilir ve salınan glikoz monomerleri anthrone tahlil^21,23. Prosedürü ve selüloz tahminini anthrone tahlil²⁴ile basitleştirmek için orijinal Updegraff yönteminin çeşitli modifikasyonları kullanılmıştır. Genel olarak, bu yöntem beş aşamaya ayrılabilir. İlk aşamada, bitki malzemesi hazırlanır. İkinci aşamada, selüloz bitki hücre duvarlarının anahtar bileşeni olduğu için ham hücre duvarı toplam biyokütleden ayrılır. Daha sonra üçüncü fazda selüloz, Updegraff reaktifi ile tedavi ederek selüloz olmayan hücre duvarı bileşenlerinden ayrılır. Dördüncü evrede asetik/nitrik aside dirençli selüloz sülfürik asit tedavisi ile glikoz monomerlerine ayrılır. Selülozun sülfürik asit tedavisi, glikotik monomerlerin sülfürik asit ile reaksiyonundan 5-hidroksimetilfurfural bileşiklerin oluşumu ile sonuçlanır. Son olarak, son aşamada, anthrone önceki faz^25’teüretilen furfural bileşik ile kaynatılarak yeşilimsi mavi bir kompleks oluşturur. Bu anthrone tabanlı kolorimetrik yöntem ilk olarak 1942 yılında Dreywood tarafından kullanılmıştır. Antroron, asidik koşullar altında 5-hidroksimetilfurfural gibi pentoz ve altıgen susuz ürünlerin furfural bileşiklerini tanımlayan bir boyadır. Altıgen ile reaksiyon pentozlara kıyasla yoğun bir renk ve daha iyi tepki üretir²⁵. Bağlı glikoz miktarı 620 nm’de spektrofotometre emilimi ile ölçülür ve yeşilimsi mavi kompleksin yoğunluğu numunedeki şeker miktarı ile doğru orantılıdır. Ölçülen absorbans değerleri, numunenin glikoz konsantrasyonunu hesaplamak için bir glikoz standart eğri gerileme hattı ile karşılaştırıldı. Ölçülen glikoz içeriği, bitki biyokütlesinin selüloz içeriğini tahmin etmek için kullanılmıştır.