Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse nach der Updegraff-Methode

Cellulose ist die primäre tragende Komponente von Zellwänden, die sowohl in primären als auch in sekundären Zellwänden vorhanden ist. Die Zellwand ist eine extrazelluläre Matrix, die Pflanzenzellen umgibt und hauptsächlich aus Zellulose, Lignin, Hemicellulose, Pektin und Matrixproteinen besteht. Ungefähr ein Drittel der Pflanzenbiomasse ist Cellulose¹ und sie spielt eine wichtige Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung, indem sie Stärke, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Baumwollfasern enthalten 95%^{Cellulose-2-Gehalt,} während Bäume 40% bis 50% Zellulose je nach Pflanzenart und Organtypen³enthalten. Die Cellulose besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Cellobiose, einem Disaccharid von Glukoserückständen, die durch β-1,4 glykosidische Bindungen⁴verbunden sind. Cellulose-Ethanol wird aus der Glukose hergestellt, die aus der in den Pflanzenzellwänden vorhandenen Zellulose gewonnen wird⁵. Cellulose Faser besteht aus mehreren Mikrofibrillen, in denen jedes Mikrofibril als Kerneinheit mit 500-15000 Glukosemonomeren^1,6fungiert. Das Cellulose-Homopolymer wird durch Plasmamembran-eingebettete Cellulose-Synthase-Komplexe (CSC’s)^1,7synthetisiert. Individuelle Cellulosesynthase A (CESA) Proteine synthetisieren Glucanketten und die angrenzenden Glucanketten sind durch Wasserstoffbindungen zu kristalliner Cellulose^1,8verbunden. Cellulose existiert in mehreren kristallinen Formen mit zwei vorherrschenden Formen, Cellulose I und Cellulose I als native Formen⁹. In höheren Pflanzen existiert Cellulose in Zellulose-I-Form, während untere Pflanzenzellulose in I-Form^10,11existiert. Insgesamt spielt die Zellulose eine wichtige Rolle bei der Stärkung und Steifigkeit der Pflanzenzellwände.

Biokraftstoffe der ersten Generation werden hauptsächlich aus Maisstärke, Rohrzucker und Rübenzucker hergestellt, die Nahrungsquellen sind, während Biokraftstoffe der zweiten Generation sich auf die Biokraftstoffproduktion aus Biomasse-Zellwandmaterial von Non-Food-Pflanzen konzentrieren¹². Die genaue Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts ist nicht nur für die Grundlagenforschung zur Zellulosebiosynthese und Zellwanddynamik wichtig, sondern auch für die Forschung über angewandte Biokraftstoffe und Bioprodukte. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und optimiert für die Abschätzung von Zellulose in der pflanzlichen Biomasse, und die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Zelluloseschätzung. Die erste gemeldete Methode zur Zelluloseschätzung wurde von Cross und Bevan 1908¹³gemeldet. Das Verfahren beruhte auf dem Prinzip der alternativen Chlorierung und Extraktion durch Natriumsulfat. Die durch die ursprüngliche sowie modifizierte Protokolle der Cross- und Bevan-Methode erhaltene Cellulose zeigte jedoch eine Kontamination kleiner Ligninfraktionen zusätzlich zu einer erheblichen Menge an Xylanen und Mannanen¹⁴. Trotz mehrerer Modifikationen zur Entfernung von Lignin und Hemicellulosen aus der Zellulosefraktion behielt die Cross-Bevan-Methode zusammen mit Cellulose eine beträchtliche Menge an Mannanen bei. Später wurde Kurschners Methode unter Verwendung von Salpetersäure und Ethanol zur Extraktion von Cellulose¹⁵entwickelt. Diese Methode besagte, dass die gesamte Lignin und 75% der Pentosane entfernt wurden, aber die wahren Cellulose-Ergebnisse waren die gleichen wie die durch Chlorierungsmethode von Cross und Bevan geschätzt. Eine andere Methode (Norman und Jenkins) wurde unter Verwendung von Methanol-Benzol, Natriumsulfat und Natriumhypochlorit zur Extraktion von Cellulose¹⁶entwickelt. Diese Methode behielt auch einen Bruchteil von Lignin (3%) und signifikante Mengen an Pentosanen, die zu einer genauen Schätzung der Zellulose führen. Später verwendeten Kiesel und Semiganowsky einen anderen Ansatz, um Cellulose mit 80% konzentrierter Schwefelsäure zu hydrolysieren, und die hydrolysierten reduzierten Zucker wurden nach Bertrands Methode¹⁷geschätzt. Die beiden Methoden, Waksman es und Stevens¹⁸ und Salo^14,19, die auf der Grundlage der Kiesel- und Semiganowsky-Methode entwickelt wurden, ergaben ebenfalls 4-5% weniger Zellulosegehalt im Vergleich zu früheren Methoden²⁰.

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Diese Methode wurde erstmals von Updegraff für die Messung von Zellulose im Jahr 1969^{beschrieben 21}. Die Updegraff-Methode integriert die Kurschner-Methode (Verwendung von Salpetersäure), Kiesel- und Seminowsky-Methoden (Hydrolyse von Cellulose in Glukosemonomere mit Schwefelsäure) mit einigen Modifikationen und den Anthron-Assay von Viles und Silverman zur einfachen kolorimetrischen Abschätzung des Glukose- und kristallinen Cellulosegehalts²². Das Prinzip dieser Methode ist die Verwendung von Essigsäure und Salpetersäure (Updegraff Reagenz), um Hemicellulose und Lignin aus den homogenisierten Pflanzengeweben zu entfernen, die essig/Salpetersäure-resistente Cellulose zur Weiterverarbeitung und Schätzung¹⁵zurücklassen. Die essigsäure-/salpetersäureresistente Cellulose wird mit 67% Schwefelsäure behandelt, um die Cellulose in Glukosemonomere zu brechen und die freigesetzten Glukosemonomere werden durch Anthron-Assay^21,23geschätzt. Mehrere Modifikationen der ursprünglichen Updegraff-Methode wurden verwendet, um das Verfahren und die Zelluloseabschätzung durch Anthron-Assay²⁴zu vereinfachen. Im Großen und Ganzen kann diese Methode in fünf Phasen unterteilt werden. In der ersten Phase wird das Pflanzenmaterial vorbereitet. In der zweiten Phase wird die Rohzellwand von der gesamten Biomasse getrennt, da Zellulose der Schlüsselbestandteil von Pflanzenzellwänden ist. Später, in der dritten Phase, wird die Zellulose durch Behandlung mit Updegraff-Reagenz von den nicht-zelluloseischen Zellwandkomponenten getrennt. In der vierten Phase wird die essigsäure-/stickstoffsäureresistente Cellulose durch Schwefelsäurebehandlung in Glukosemonomere gebrochen. Die Schwefelsäurebehandlung von Cellulose führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylfurfuralverbindungen aus der Reaktion von Glukosemonomeren mit Schwefelsäure. Schließlich erzeugt der Anthron in der letzten Phase einen grünlich-blauen Komplex durch Kochen mit der furfuralen Verbindung, die in der vorherigen Phase²⁵erzeugt wurde. Diese anthronbasierte kolorimetrische Methode wurde erstmals 1942 von Dreywood verwendet. Anthrone ist ein Farbstoff, der Furfuralverbindungen von Pentose und Hexose dehydrierte Produkte wie 5-Hydroxymethylfurfural identifiziert, unter sauren Bedingungen. Reaktion mit Hexose produziert eine intensive Farbe und bessere Reaktion im Vergleich zu Pentoses²⁵. Die Menge der gebundenen Glukose wird durch Spektralphotometer-Absorption bei 620 nm gemessen und die Intensität des grünlich-blauen Komplexes ist direkt proportional zur Zuckermenge in der Probe. Die gemessenen Absorptionswerte wurden mit einer Regressionslinie der Glukose-Standardkurve verglichen, um die Glukosekonzentration der Probe zu berechnen. Der gemessene Glukosegehalt wurde verwendet, um den Zellulosegehalt der pflanzenden Biomasse zu schätzen.