הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff

תאית היא המרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא, אשר קיים הן בקירות התא הראשי והן בקירות התא המשני. דופן התא היא מטריצה חוץ-תאית המקיפה תאי צמחים ומורכבת בעיקר מחלבוני תאית, ליגנין, המיצלולוז, פקטין ומטריצה. כשליש מהביומסה של הצמחים היא תאית¹ והיא ממלאת תפקידים משמעותיים בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. סיבי כותנה מכילים 95% תאית² תוכן, בעוד עצים מכילים 40% עד 50% של תאית בהתאם למין הצמח וסוגי איברים³. התאית מורכבת מיחידות חוזרות של צ’לוביוז, מפרק של שאריות גלוקוז המחוברות על ידי β-1,4 קשרים גליקופידיים⁴. אתנול צלולוסי מופק מן הגלוקוז נגזר תאית נוכח בקירות תא הצמח⁵. סיבים צלולוסיים מורכבים ממספר סיבי מיקרו שבהם כל סיב מיקרו פועל כיחידת ליבה עם מונומרים גלוקוז 500-15000^1,6. homopolymer תאית מסונתז על ידי קרום פלזמה מוטבע קומפלקסים סינתאז תאית (CSC)^1,7. חלבוני סינתאז תאית בודדים A (CESA) מסנתזים שרשראות גלוקן ושרשראות הגלוקן הסמוכות מחוברות באמצעות קשרי מימן ליצירת תאית גבישית^1,8. תאית קיימת במספר צורות גבישיות עם שתי צורות דומיננטיות, תאית Iα ו תאית Iβ כצורות מקוריות⁹. בצמחים גבוהים יותר, תאית קיימת בצורת תאית Iβ בעוד תאית הצמח התחתון קיים בצורת Iα^10,11. בסך הכל, התאית ממלאת תפקיד משמעותי בהקניית כוח ונוקשות לקירות תאי הצמח.

דלקים ביולוגיים מהדור הראשון מיוצרים בעיקר מעמילן תירס, סוכרי קנים וסוכרי סלק, שהם מקורות מזון, ואילו דלקים ביולוגיים מהדור השני מתמקדים בייצור דלק ביולוגי מחומר קיר תא ביומסה שאינו מזון¹². הערכה מדויקת של תכולת תאית גבישית חשובה לא רק למחקר בסיסי על ביוסינתזה תאית ודינמיקה של דופן התא, אלא גם למחקר יישומי של דלק ביולוגי ומוצרי ביו. שיטות שונות פותחו ואופטימיזציה להערכת תאית בביומסה הצמחית, ושיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. השיטה המדווחת הראשונה להערכת תאית הייתה על ידי קרוס ובבן בשנת 1908¹³. השיטה התבססה על העיקרון של כלור חלופי ומיצוי על ידי נתרן גופרתי. עם זאת, תאית שהושגה על ידי המקורי, כמו גם פרוטוקולים שונה של שיטת קרוס בוואן הראה זיהום של שברים קטנים של ליגנין בנוסף כמות משמעותית של xylans ו mannans¹⁴. למרות מספר שינויים להסרת ליגנין והמיצלולוזים מהשבר התאי, שיטת Cross-Bevan שמרה על כמות ניכרת של מנאנים יחד עם תאית. מאוחר יותר, השיטה של Kurschner פותחה על ידי שימוש בחומצה חנקתית ואתנול כדי לחלץ תאית¹⁵. שיטה זו קבעה כי סך ליגנין ו 75% של pentosans הוסרו אבל התוצאות תאית האמיתית היו זהים לאלה המוערכים על ידי שיטת כלור של קרוס בוואן. שיטה נוספת (נורמן וג’נקינס) פותחה על ידי שימוש במתנול-בנזן, נתרן סולפט ונתרן היפוכלוריט לחילוץ תאית¹⁶. שיטה זו גם שמרה על חלק קטן של ליגנין (3%) וכמויות משמעותיות של פנטוסנים המובילות להערכת תאית מדויקת. מאוחר יותר, Kiesel ו Semiganowsky השתמשו בגישה שונה כדי הידרוליזה תאית באמצעות 80% מרוכז חומצה גופרתית, ואת סוכרים מופחתים הידרוליזה הוערכו על ידי השיטה של ברטרנד¹⁷. שתי השיטות, של וקסמן וסטיבנס¹⁸ וסאלו^14,19 שפותחו על בסיס השיטה של קיזל וסמיגנובסקי, הניבו גם 4-5% פחות תוכן תאית בהשוואה לשיטות^{קודמות 20}.

שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תכולת תאית גבישית. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Updegraff למדידת תאית בשנת 1969²¹. שיטת Updegraff משלבת את שיטת קורשנר (שימוש בחומצה חנקתית), שיטות קיזל וסמינובסקי (הידרוליזה של תאית לתוך מונומרים של גלוקוז באמצעות חומצה גופרתית) עם כמה שינויים, ואת מבחני האנתרון של ויילס וסילברמן להערכת צבעים פשוטה של גלוקוז ותכולת תאית גבישית²². העיקרון של שיטה זו הוא השימוש בחומצה אצטית וחומצה חנקתית (מגיב Updegraff) כדי לחסל hemicellulose ו ליגנין מרקמות הצמח הומוגנית, אשר משאיר תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית לעיבוד נוסף והערכת¹⁵. תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מטופלת עם 67% חומצה גופרתית כדי לשבור את תאית לתוך מונומרים גלוקוז מונומרים גלוקוז שוחרר מוערך על ידי anthrone assay^21,23. מספר שינויים בשיטת Updegraff המקורית שימשו כדי לפשט את ההליך ואת הערכת תאית על ידי anthrone assay²⁴. באופן כללי, ניתן לחלק שיטה זו לחמישה שלבים. בשלב הראשון, החומר הצמחי מוכן. בשלב השני, קיר התא הגולמי מופרד מן הביומסה הכוללת, כמו תאית היא המרכיב העיקרי של קירות התא הצמח. מאוחר יותר, בשלב השלישי, התאית מופרדת מרכיבי דופן התא הלא צלולוסי על ידי טיפול עם ריאגנט Updegraff. בשלב הרביעי, תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מחולק מונומרים גלוקוז על ידי טיפול חומצה גופרתית. טיפול חומצה גופרתית של תוצאות תאית היווצרות של תרכובות 5-hydroxymethylfurfural מהתגובה של מונומרים גלוקוז עם חומצה גופרתית. לבסוף, בשלב האחרון, האנתרון יוצר קומפלקס כחול ירקרק על ידי רותחים עם תרכובת furfural שנוצר בשלב הקודם²⁵. שיטה קוורימטרית מבוססת אנתרון זו שימשה לראשונה בשנת 1942 על ידי דרייווד. אנתרון הוא צבע המזהה תרכובות פורפורליות של מוצרים מיובשים פנטוז ו hexose כגון 5-hydroxymethylfurfural, בתנאים חומציים. תגובה עם הקסוס מייצרת צבע אינטנסיבי ותגובה טובה יותר בהשוואה pentoses²⁵. כמות הגלוקוז המאוגד נמדדת על ידי ספיגת ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר ואת עוצמת קומפלקס כחול ירקרק הוא פרופורציונלי ישירות לכמות הסוכר במדגם. ערכי הספיגה הנמדדים הושוו לקו רגרסיה של עקומת גלוקוז סטנדרטית לחישוב ריכוז הסוכר של המדגם. תכולת הגלוקוז הנמדדת שימשה להערכת תכולת תאית של ביומסה הצמח.