Preparação da amostra de plantas para medição de conteúdo nucleoídeo/nucleotídeo com hplc-MS/MS
Summary
Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.
Abstract
Nucleosídeos/nucleotídeos são blocos de construção de ácidos nucleicos, partes de cosubstrates e coenzimas, moléculas de sinalização celular e portadores de energia, que estão envolvidos em muitas atividades celulares. Aqui, descrevemos um método rápido e confiável para a qualificação absoluta do conteúdo nucleosídeo/nucleotídeo nas plantas. Resumidamente, 100 mg de material vegetal homogeneizado foram extraídos com 1 mL de tampão de extração (metanol, acetonitrilo e água a uma razão de 2:2:1). Mais tarde, a amostra foi concentrada cinco vezes em um secador congelado e, em seguida, injetada em um HPLC-MS/MS. Nucleotídeos foram separados em uma coluna de carbono grafitado poroso (PGC) e nucleosídeos foram separados em uma coluna C18. As transições em massa de cada nucleosídeo e nucleotídeo foram monitoradas pela espectrometria de massa. O conteúdo dos nucleosídeos e nucleotídeos foram quantificados em relação aos seus padrões externos (ESTDs). Usando este método, portanto, os pesquisadores podem facilmente quantificar nucleosídeos/nucleotídeos em diferentes plantas.
Introduction
Nucleosídeos/Nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos, que são os precursores de ácidos nucleicos e muitos coenzymes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), e importante na síntese de macromoléculas como fosfolipídios, glicólipídios e polissacarídeos. Estruturalmente, o nucleosídeo contém uma nucleobase, que pode ser uma adenina, guanina, uracil, citosina ou timina, e um moiety de açúcar, que pode ser uma ribose ou uma desoxiribose1,2. Os nucleotídeos têm até três grupos fosfatos ligados à posição de 5 carbonos da moiety açucarada dos nucleosídeos3. O metabolismo dos nucleotídeos nas plantas é essencial para a germinação de sementes e o crescimento da folha4,5,6. Para entender melhor seus papéis fisiológicos no desenvolvimento das plantas, devem ser estabelecidos os métodos para a quantificação absoluta de diferentes nucleosídeos/nucleotídeos in vivo.
Uma das abordagens mais utilizadas para medir nucleosídeos/nucleotídeos emprega uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) juntamente com um detector ultravioleta visível (UV-VIS)detector 4,7,8,9,10,11. Em 2013, usando HPLC, Dahncke e Witte quantificaram vários tipos de nucleosídeos em Arabidopsis thaliana7. Eles identificaram um conteúdo melhorado de guanosina em um mutante de inserção T-DNA no gene guanosina deaminase em comparação com a planta do tipo selvagem. Outro nucleosídeo pirimidina, o citidina, também foi detectado quantitativamente nas plantas que empregam esse método, o que resultou na identificação de um gene deaminase de citidina de boa fé 4. Com base no detector UV, este método, no entanto, não pode distinguir facilmente os nucleosídeos que têm espectros e tempos de retenção semelhantes, por exemplo, guanosina ou xanthosina. O limite de detecção do método HPLC é relativamente alto, portanto, é frequentemente utilizado para a medição de alto teor de nucleosídeos in vivo, como citidina, uridina e guanosina.
Além disso, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) também pode ser usada na medição nucleosídea. Beneficiando-se disso, Hauck et. al. detectou com sucesso uridina e ácido úrico, que é um metabólito a jusante da via catabólica nucleosídeo, nas sementes de A. thaliana12. No entanto, o GC é normalmente usado para separar compostos voláteis, mas não é adequado para as substâncias termicamente labile. Portanto, uma cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) é provavelmente uma técnica analítica mais adequada e precisa para a identificação in vivo, separação e quantificação dos nucleosídeos/nucleotídeos13,14. Vários estudos anteriores relataram que uma coluna HILIC pode ser usada para a separação de nucleosídeos e nucleotídeos15,16 e padrões internos isotopicamente rotulados foram empregados para a quantificação composta17. No entanto, ambos os componentes são relativamente caros, especialmente os padrões comerciais rotulados de isótopos. Aqui, relatamos uma abordagem LC-MS/MS economicamente aplicável para medição de nucleosídeos/nucleotídeos. Este método já foi utilizado com sucesso para a quantitação de diversos nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, em plantas e Drosophila. Além disso, o método que relatamos aqui também pode ser usado em outros organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os organismos contêm vários nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo os canônicos e aberrantes. No entanto, a origem e os pontos finais metabólicos deles, especialmente os nucleosídeos modificados, ainda são obscuros. Além disso, o entendimento atual da função e da homeostase do metabolismo nucleosídeos/nucleotídeos continua a ser explorado e expandido. Para investigá-los, é necessário utilizar um método preciso e padrão-ouro para esses metabólitos de identificação e quantificação. Aqui, descrevemos um…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (KJQN202060), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900907), a Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20190528), o Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia (CRP/CHN20-04_EC) para M.C., e os Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (LGZD202004) para X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referências
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