HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비
Summary
식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.
Abstract
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.
Introduction
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기4,7,8,9,10,11과결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.
또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드분리(15,16) 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중앙 대학 (KJQN202060), 중국 국립 자연 과학 재단 (31900907), 장쑤성의 자연 과학 재단 (BK20190528), 유전자 공학 및 생명 공학 국제 센터 (CRP / CHN20-04_EC.C) 및 중앙 대학 (LZ20)의 기초 연구 기금 (LZ20)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referências
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
