本文旨在提出一种关于如何构建点变异荧光相关光谱(svFCS)显微镜以测量活细胞质膜处分子扩散的协议。
活细胞中的动态生物过程,包括与质膜组织相关的过程,分别发生在各种空间和时间尺度上,从纳米到微米,从微秒到几分钟。如此广泛的生物过程对传统的显微镜方法提出了挑战。在这里,我们详细介绍了使用定制的经典荧光显微镜实施点变异荧光相关光谱(svFCS)测量的过程。该协议包括svFCS设置的特定性能检查以及svFCS在生理条件下对活细胞质膜进行分子扩散测量的指南。此外,我们还提供了通过胆固醇氧化酶处理破坏质膜筏纳米结构域的程序,并演示了质膜横向组织的这些变化如何通过svFCS分析揭示。总之,这种基于荧光的方法能够以适当的空间和时间分辨率提供有关质膜横向组织的前所未有的细节。
质膜组织的复杂性
目前对细胞膜组织的理解必须考虑几个方面1。首先,复杂的脂质组成不仅在细胞类型之间变化,而且在单个细胞(膜细胞器/质膜)内也不同。此外,相关或内在膜蛋白大多组织在动态多聚体复合物中,大结构域延伸到膜外,比单独的跨膜结构域的面积大得多。此外,膜相关蛋白表现出特定的脂质结合或脂质相互作用能力,在调节蛋白质功能中起作用。这些直接取决于脂质的局部组成和可及性2。
最后,由于膜蛋白的固有不对称结构和脂质的分布,在两个膜小叶之间观察到显着的不对称水平。事实上,合成和水解之间的脂质代谢平衡,结合小叶之间的脂质翻转,产生诸如不对称分布。由于穿过双层的任何传输都受到通过膜的疏水性内部移动极性头基团所需的自由能的约束,因此通常由选择性转运蛋白辅助。对于每种细胞类型,不对称性往往得到牢固的维持。总之,这些因素促成质膜3,4的横向不均匀性或区室化。
我们通过考虑双层内部和整个双层的固有分子扩散来丰富质膜的这种表示,这有助于在十分之一到数百纳米和微秒到秒的范围内动态横向非均质性。例如,脂质依赖性膜纳米域 – 所谓的脂质筏,定义为胆固醇和富含鞘脂的信号平台 – 有助于质膜的区室化5,6。然而,目前关于膜组织的观点并不仅限于脂筏。膜纳米结构域在组成,起源和功能上更加复杂和异质。尽管如此,它们在质膜上的存在必须紧密协调,蛋白质和脂质之间的动态相互作用似乎在膜纳米域1,3,7,8的空间分布和化学修饰中很重要。
svFCS原理及其在探测质膜组织的应用
尽管主要通过生物物理技术在膜结构域分析方面取得了很大进展,但需要用适当的空间和时间分辨率来细化决定质膜局部组织的决定因素。基于跟踪单个分子的行列式提供了出色的空间精度,并允许表征不同的运动模式9,10,11,12,但具有有限的时间分辨率和经典的低相机帧速率,并且需要更多的实验工作来记录大量轨迹。或者,膜组分的扩散系数可以通过光漂白后的荧光恢复(FRAP)13 或荧光相关光谱(FCS)14来评估。后者受到更多的关注,主要是因为其灵敏度和选择性高,显微检测体积大,侵入性低,动态范围宽15。
FCS的概念基础是由Magde及其同事在大约50年前16,17年引入的。它基于以高时间分辨率(从μs到s)记录荧光发射的波动18。在其现代版本中,活细胞的测量是通过位于感兴趣区域(例如,在质膜处)内的小共聚焦激发体积(〜0.3飞升)进行的;通过扩散进出观察体积的荧光分子产生的荧光信号以非常高的时间分辨率(即每个光子到达探测器的时间)收集。然后,计算信号以生成自相关函数(ACF),从中提取分子停留在焦点体积内的平均时间td (扩散时间),以及观察体积中存在的粒子的平均数量(N),这与ACF的振幅成反比。最后一个参数可能是关于观察体积内分子浓度的有用信息。
从那时起,由于生物光子学仪器的快速发展,越来越多的食品接触物质模式已经实施,从而可以描述生命系统中发生的动态现象。尽管如此,分子物种将经历扩散系数值的更重叠分布,这通常反映在异常扩散特征中,其中分子在时间19中以非线性关系扩散,并且难以识别这种异常子扩散的生物学意义。过去,通过记录FRAP从各种大小的区域(而不仅仅是一个区域)的分子扩散,从而提供了额外的空间信息,在某种程度上克服了这一困难。例如,这使得膜微域20,21,22的概念化成为可能。
通过改变观察焦点体积的大小,建立了将该策略转换为FCS测量(即所谓的点变异荧光相关光谱(svFCS)),从而允许在不同的空间尺度上记录荧光的波动23。因此,svFCS方法提供了间接的空间信息,允许识别和确定所研究分子的分子扩散模式和膜分区类型(孤立与连续域24)。通过将扩散时间td 绘制为腰部(ω)值定义的各种空间尺度的函数,在这种情况下对应于检测光束半径大小23,25,可以表征给定分子在给定生理条件下的扩散规律。因此,svFCS是时域26中单粒子跟踪的完美模拟。在布朗扩散约束下,人们应该期望扩散时间td 和腰部ω之间存在严格的线性关系(图1)23,25。扩散定律偏离该方案的起源可归因于非排他性原因,例如细胞骨架网格,分子拥挤,纳米域中的动态分割,或这些和其他效应的任意组合(图1),并且需要通过实验进行测试25。
在这里,我们为从头开始构建的定制svFCS光学系统的日常使用提供了所有必要的控制检查点,这补充了我们之前关于该实验方法的协议审查27,28 。此外,作为概念的证明,我们提供了有关设置校准,细胞制备,数据采集和分析的指南,以建立Thy1-GFP的svFCS扩散定律(DL),Thy1-GFP是一种质膜糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,已知其定位于脂筏纳米域29。最后,我们证明了胆固醇氧化酶处理对脂筏纳米结构域的部分不稳定如何影响Thy1-GFP的扩散特性。此外, 补充材料中还提供了从头开始构建 svFCS 设置的详细说明。
在这里,我们描述了svFCS模块在标准荧光显微镜上的实现,这是一种强大的实验方法,可以通过FCS扩散规律分析来破译活细胞中质膜组织的动力学。从概念上讲,svFCS基于一个简单的原理:在时域中测量荧光的相关性,同时改变照明区域23的大小。该策略有助于从微观测量中推断出纳米信息,这有助于破译在稳态25和生理过程30,31,32,33下有助于质膜组织的主要物理化学元素。总而言之,这些svFCS分析明确证明了脂质依赖性纳米结构域在各种细胞类型中的存在及其对调谐不同信号传导事件的直接影响。
在此框架内,在构建svFCS设置以优化光子预算并最小化光学像差时,需要考虑一些光学方面。因此,我们建议使用显微镜,在执行svFCS测量时,可以从中取出管透镜。此外,单个光圈在svFCS设置中起着关键作用:它改变物镜后孔径处的光束尺寸,从而直接改变有效腰围尺寸(即有效激发体积)。光束直径应适合物镜背瞳,以获得最小的腰围尺寸34。此选项有助于调整腰围大小,确保优化光子预算,并且易于实施。最后,沿着光路使用最少数量的光学部件;系统越不复杂,丢失的光子就越少。所有这些选项都显著提高了svFCS实验的鲁棒性。
关于协议本身,必须考虑几个关键步骤。最重要的是光路的适当对准,这对于成功的svFCS测量至关重要(协议,第2节)。通过分析来自2 nM Rh6G溶液的荧光信号,在300 μW激光照射下,该荧光信号应为~200 kHz,这很容易检查。所有虹膜都应打开,并且ACF应具有重要的振幅(通常为G0~1.5-2.0)。另一个临界点涉及细胞及其制备用于svFCS分析(实验方案,第4-8节)。它们的密度必须进行调整,以便可以观察的分离细胞进行分析。非贴壁细胞必须通过使用聚-L-赖氨酸溶液固定在腔室盖玻片上。来自细胞标记的荧光信号不应太强,否则会导致难以拟合的非常平坦的ACF,并且拟合参数存在重要误差。此外,细胞中的非均匀标记和荧光聚集使svFCS测量值极难解释。最后,胆固醇氧化酶治疗影响细胞活力,svFCS分析不应超过治疗后一小时。记录来自上质膜的荧光波动也更好,因为它不附着在载体上,并且由于与载体的物理相互作用而没有阻碍分子扩散的风险。
由于调节检测体积的方式多种多样,svFCS技术已经取得了足够的进展,可以在不同的方法中使用,从而可以研究活细胞中的各种生物过程。调整激发体积大小的一种替代方法是使用可变扩束镜35。也可以通过记录来自质膜截距沿z方向36的荧光信号来简单地调节照明区域的大小。这可以在标准共聚焦显微镜上完成,该显微镜已经开发了一个理论框架来推导扩散定律37,38。
尽管svFCS方法提供了时空分辨率,这对于表征质膜的不均匀侧向组织是必要的,但限制的几何模式并不相互排斥。 t0 在一个方向或另一个方向上的偏差完全揭示了约束25 的主导模式。此外,本svFCS方法的另一个重要限制是由于经典的光学衍射极限(~200 nm)造成的。毫无疑问,这比限制细胞质膜内分子的域更大。因此,限制的分析是从扩散定律推断出的 t0 值推断出来的。
通过实现替代方法克服了此缺点。最初,使用用纳米孔钻孔的金属薄膜提供了照亮非常小的膜面积的可能性(即,低于半径在75至250nm之间的单个纳米孔径的光学衍射极限)39。因此,报道了从理论扩散规律预测的孤立域组织的过渡态,并允许细化纳米膜非均质性的特征尺寸,并定量估计脂质依赖性纳米域39所占据的表面积。或者,纳米照明也已经开发使用近场扫描光学显微镜40 或平面光学纳米天线41。最近,将受激发射耗尽(STED)和FCS相结合,提供了一种强大而灵敏的工具,以非常高的空间分辨率记录扩散定律。这种STED-FCS提供了在短时间内发生的纳米级分子扩散特性,允许研究质膜42,43处脂质探针的动态组织。然而,STED过程中荧光的不完全抑制挑战了FCS中自相关曲线的分析。
已经开发了一种新的拟合模型来克服这一困难,提高了扩散时间和平均分子数测量44的准确性。最后,对于质膜上的缓慢分子扩散,svFCS原理可以应用于通过图像相关光谱45记录的数据。最近,已经证明,将原子力显微镜(AFM)与成像全内反射FCS(ITIR-FCS)相结合有助于改进阻碍分子在质膜上扩散的机制的性质,特别是由于纳米结构域46的高密度,特别是在渗流阈值膜构型附近。
综上所述,svFCS建立的扩散规律为推断动态集体脂质和膜蛋白关联产生的局部异质性提供了实验证据。正如Wohland及其同事46所说,“FCS扩散定律分析仍然是从动态信息中推断出分辨率极限以下的结构和组织特征的宝贵工具”。尽管如此,我们仍然需要开发新的模型来完善扩散定律的解释,从而更好地理解质膜上发生的分子事件的动力学。
The authors have nothing to disclose.
SB,SM和DM得到了CNRS,Inserm和艾克斯 – 马赛大学的机构资金以及法国国家研究机构(ANR-17-CE15-0032-01和ANR-18-CE15-0021-02)和法国“阿文尼尔投资”(ANR-10-INBS-04法国生物成像,ANR-11-LABX-054实验室信息)的项目赠款的支持。KW承认“生物技术南”,这是一个跨学科的环境博士研究计划,在生物技术和纳米技术领域知道。EB 感谢波兰国家科学中心 (NCN) 在 2016/21/D/NZ1/00285 项目下提供的财政支持,以及法国政府和法国驻波兰大使馆的财政支持。MŁ感谢波兰发展部(CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19)和国家研发中心(Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17)的财政支持。TT感谢波兰国家科学中心(NCN)在项目编号2016/21/B/NZ3/00343和弗罗茨瓦夫生物技术中心(KNOW)的财政支持。
Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
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Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
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Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
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25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
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20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
Beam block – active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
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Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
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USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
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750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
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Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
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Biological Reagents and Materials | |||
Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |