JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Published: November 12, 2020
doi:
10.3791/61823
, , , , , , ,
1CNRS, Inserm, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology,University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences,University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel,Aix Marseille Univ

Summary

Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.

Abstract

Dynamische biologische processen in levende cellen, inclusief die geassocieerd met plasmamembraanorganisatie, vinden plaats op verschillende ruimtelijke en temporele schalen, variërend van respectievelijk nanometers tot micrometers en microseconden tot minuten. Zo’n breed scala aan biologische processen daagt conventionele microscopiebenaderingen uit. Hier beschrijven we de procedure voor het implementeren van spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) metingen met behulp van een klassieke fluorescentiemicroscoop die is aangepast. Het protocol omvat een specifieke prestatiecontrole van de svFCS-opstelling en de richtlijnen voor moleculaire diffusiemetingen door svFCS op het plasmamembraan van levende cellen onder fysiologische omstandigheden. Daarnaast bieden we een procedure voor het verstoren van plasmamembraanvlot nanodomeinen door cholesteroloxidasebehandeling en laten we zien hoe deze veranderingen in de laterale organisatie van het plasmamembraan kunnen worden onthuld door svFCS-analyse. Kortom, deze op fluorescentie gebaseerde methode kan ongekende details geven over de laterale organisatie van het plasmamembraan met de juiste ruimtelijke en temporele resolutie.

Introduction

De complexiteit van plasmamembraanorganisatie
Het huidige begrip van celmembraanorganisatie moet rekening houden met verschillende aspecten1. Ten eerste varieert een complexe lipidesamenstelling niet alleen tussen celtypen, maar ook binnen een enkele cel (membraanorganellen / plasmamembraan). Bovendien zijn geassocieerde of intrinsieke membraaneiwitten meestal georganiseerd in dynamische multimere complexen, met grote domeinen die zich buiten het membraan uitstrekken, goed voor een aanzienlijk groter gebied dan dat van de transmembraandomeinen alleen. Bovendien vertonen membraan-geassocieerde eiwitten specifieke lipidebindende of lipide-interagerende capaciteiten die een rol spelen bij het reguleren van de eiwitfunctie. Deze zijn direct afhankelijk van de lokale samenstelling en toegankelijkheid van de lipiden2.

Ten slotte wordt een significant niveau van asymmetrie waargenomen tussen twee membraanfolders vanwege de intrinsieke asymmetrische structuur van membraaneiwitten en de verdeling van lipiden. Inderdaad, een lipide metabolische balans tussen synthese en hydrolyse, gecombineerd met lipide flip-flop tussen de folders, genereert een dergelijke asymmetrische verdeling. Omdat elk transport over de bilayer wordt beperkt door de vrije energie die nodig is om de polaire kopgroep door het hydrofobe binnenste van de membranen te bewegen, wordt het meestal bijgestaan door selectieve transporters. Voor elk celtype wordt de asymmetrie meestal stevig gehandhaafd. Al met al dragen deze factoren bij aan laterale inhomogeniteit of compartimentering van het plasmamembraan 3,4.

We verrijken deze representatie van het plasmamembraan door rekening te houden met de intrinsieke moleculaire diffusie binnen en over de bilayer, die bijdraagt aan de dynamische laterale heterogeniteit op een schaal van tienden tot honderden nanometers en microseconden tot seconden. Lipide-afhankelijke membraan nanodomeinen – de zogenaamde lipide vlotten, gedefinieerd als cholesterol, en sfingolipide-rijke signaleringsplatforms – dragen bijvoorbeeld bij aan de compartimentering van het plasmamembraan 5,6. De huidige visie op membraanorganisatie is echter niet beperkt tot lipidevlotten alleen. Membraan nanodomeinen zijn complexer en heterogener in samenstelling, oorsprong en functie. Toch moet hun aanwezigheid op het plasmamembraan nauw worden gecoördineerd en dynamische interacties tussen eiwitten en lipiden lijken belangrijk te zijn bij de ruimtelijke verdeling en chemische modificatie van membraannanodomeinen 1,3,7,8.

Het svFCS-principe en de toepassing ervan om de organisatie van het plasmamembraan te onderzoeken
Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in de analyse van membraandomeinen, voornamelijk door middel van biofysische technieken, moeten de determinanten die de lokale organisatie van het plasmamembraan dicteren, worden verfijnd met de juiste ruimtelijke en temporele resolutie. Determinanten op basis van het volgen van individuele moleculen bieden uitstekende ruimtelijke precisie en maken de karakterisering van verschillende bewegingsmodi 9,10,11,12 mogelijk, maar hebben een beperkte temporele resolutie met klassieke lage cameraframesnelheden en vereisen meer experimentele inspanning om een aanzienlijk aantal trajecten vast te leggen. Als alternatief kan de diffusiecoëfficiënt van membraancomponenten worden geëvalueerd door Fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP)13 of Fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS)14. Dit laatste heeft meer aandacht gekregen, vooral vanwege de hoge gevoeligheid en selectiviteit, het microscopische detectievolume, de lage invasiviteit en het brede dynamische bereik15.

De conceptuele basis van FCS werd ongeveer 50 jaar geleden geïntroduceerd door Magde en collega’s 16,17. Het is gebaseerd op het registreren van de fluctuatie van fluorescentie-emissie met een hoge temporele resolutie (van μs tot s)18. In zijn moderne versie worden metingen in levende cellen uitgevoerd door een klein confocaal excitatievolume (~ 0,3 femtoliters) geplaatst binnen een interessant gebied (bijvoorbeeld bij het plasmamembraan); het fluorescentiesignaal dat wordt gegenereerd door diffusie van fluorescerende moleculen die in en uit het waarnemingsvolume gaan, wordt verzameld met een zeer hoge temporele resolutie (d.w.z. de aankomsttijd van elk foton op de detector). Vervolgens wordt het signaal berekend om de autocorrelatiefunctie (ACF) te genereren, waaruit de gemiddelde tijd td (diffusietijd) wordt geëxtraheerd waarvoor een molecuul binnen het focale volume blijft, samen met het gemiddelde aantal deeltjes (N), aanwezig in het waarnemingsvolume, dat omgekeerd evenredig is met de amplitude van het AKF. Deze laatste parameter kan nuttige informatie zijn over de molecuulconcentratie binnen het waarnemingsvolume.

Sindsdien is een groeiend aantal FCS-modaliteiten geïmplementeerd dankzij de zich snel ontwikkelende instrumentatie in de biofotonica, waardoor dynamische verschijnselen in levende systemen kunnen worden beschreven. Toch zou een moleculaire soort een meer overlappende verdeling van de diffusiecoëfficiëntwaarden ervaren, die meestal wordt weerspiegeld door een abnormale diffusiekarakteristiek, waarbij moleculen diffunderen met een niet-lineaire relatie in tijd19, en moeite met het identificeren van de biologische betekenis van deze abnormale subdiffusie. In het verleden is deze moeilijkheid enigszins overwonnen door de moleculaire diffusie door FRAP te registreren vanuit gebieden van verschillende groottes, in plaats van vanuit slechts één gebied, waardoor aanvullende ruimtelijke informatie wordt verkregen. Dit maakte bijvoorbeeld de conceptualisering van membraanmicrodomeinen 20,21,22 mogelijk.

Een vertaling van deze strategie naar FCS-metingen (d.w.z. de zogenaamde spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie (svFCS)) werd tot stand gebracht door de grootte van het focale waarnemingsvolume te variëren, waardoor de fluctuatie in fluorescentie op verschillende ruimtelijke schalen kon worden geregistreerd23. De svFCS-benadering biedt dus indirecte ruimtelijke informatie die de identificatie en bepaling van moleculaire diffusiemodi en het type membraanpartitionering (geïsoleerde versus aaneengesloten domeinen24) van bestudeerde moleculen mogelijk maakt. Door de diffusietijd td uit te zetten als een functie van de verschillende ruimtelijke schalen gedefinieerd door de taille (ω) waarde, die overeenkomt met de detectiestraalgrootte in dit geval23,25, kan men de diffusiewet van een bepaald molecuul in een bepaalde fysiologische toestand karakteriseren. Het svFCS is daarom een perfect analoog aan single-particle tracking in het tijdsdomein26. Onder de Brownse diffusiebeperking mag men een strikt lineaire relatie verwachten tussen de diffusietijd td en de taille ω (figuur 1)23,25. De oorsprong van de afwijking van de diffusiewet van dit schema kan worden toegeschreven aan niet-exclusieve redenen, zoals cytoskelet meshwork, moleculaire crowding, dynamische partitionering in nanodomeinen, of een combinatie van deze en andere effecten (figuur 1), en moet experimenteel worden getest25.

Hier bieden we alle benodigde controlepunten voor het dagelijks gebruik van een op maat gemaakt svFCS-optisch systeem dat helemaal opnieuw is gebouwd, dat een aanvulling vormt op onze eerdere protocolbeoordelingen27,28 over die experimentele aanpak. Verder geven we als proof of concept richtlijnen met betrekking tot de kalibratie van de opstelling, de voorbereiding van cellen, gegevensverzameling en analyse voor de vaststelling van svFCS-diffusiewet (DL) voor Thy1-GFP, een plasmamembraan glycosylphosphatidylinositol-verankerd eiwit, waarvan bekend is dat het gelokaliseerd is in lipide-vlot nanodomeinen29. Ten slotte laten we zien hoe de gedeeltelijke destabilisatie van lipide-vlot nanodomeinen door cholesteroloxidasebehandeling de diffusie-eigenschappen van Thy1-GFP beïnvloedt. Daarnaast is een gedetailleerde beschrijving van het bouwen van een svFCS-opstelling vanaf nul in aanvullend materiaal.

Protocol

1. Specificatie instellen voor het assembleren van een op maat gemaakte svFCS-opstelling OPMERKING: De eenvoud van de voorgestelde svFCS-installatie maakt eenvoudige installatie, bediening en onderhoud mogelijk tegen lage kosten, terwijl de efficiëntie bij het herstellen van fotonen wordt gegarandeerd. Zie Aanvullend materiaal voor meer informatie. Experimentele ruimte en veiligheid Installeer het systeem in een ruimte gestabiliseerd rond 21 °C. Vermijd directe luchtstroom op de passieve (of actieve) optische tafel en volg de laserveiligheidsregels voor optische uitlijning. Hardware en softwareOPMERKING: Aanvullend materiaal beschrijft de installatiestappen die in figuur 2 worden weergegeven. Schrijf de belangrijkste acquisitie- en besturingssoftware in LabVIEW met behulp van een statusmachine en gebeurtenisstructuurarchitectuur waarbij een multifunctioneel acquisitiebord de meeste controllers aandrijft.OPMERKING: De correlator, laser en vermogensmeter worden bestuurd of bewaakt door hun eigen software. Pas de hardware- en software-installatieprocedures aan de gebruikte hardware aan. Optische opstellingOPMERKING: Figuur 3 illustreert de optische bankmodules die in de volgende secties worden gebruikt om de kwaliteit van de optische uitlijningen te regelen. Alle specificaties van de optische elementen worden vermeld in de tabel met materialen. De procedure om de opstelling te bouwen wordt uitgebreid beschreven in aanvullend materiaal. Dit systeem bestaat uit een continue golflaser, een gemotoriseerde omgekeerde microscoop uitgerust met een dompelwaterobjectief, een lawinefotodiodedetector gekoppeld aan een enkele fotonentelmodule en een hardwarecorrelator. Een microscoop incubatiekamer met trillingsvrije kachels is speciaal ontworpen om de temperatuur te regelen voor experimenten op levende cellen. Volgens afspraak komt de XY-as overeen met het loodrechte vlak van het optische pad en de Z-as met het optische pad. 2. Dagelijks controlepunt voordat het experiment wordt uitgevoerd Bestuur het excitatiepad (figuur 3, & ). Open alle irismembranen. Meet het laservermogen met de vermogensmeter, waardoor de eerste iris volledig open blijft. Draai aan de halfgolfplaat (HWP) om het maximale vermogen te vinden. Controleer de uitlijning met behulp van de irissen als het laservermogen lager is dan normaal en verplaats L1 en M1 afwisselend, indien nodig. Noteer de vermogenswaarde in het laboratoriumnotitieboekje van het experiment. Beheer het detectiepad (figuur 3, & ). Plaats het water, een deklip en een druppel van een 2 nM rhodamine 6G (Rh6G) oplossing op het doel. Als het fluorescentiesignaal (telgetal op de APD, opgenomen met de LabVIEW-software) lager is dan normaal, maak dan de Rh6G-oplossing opnieuw, controleer de positionering en het nummer van de coverslip op de objectieflens of elimineer bubbels, indien aanwezig. Als het fluorescentiesignaal nog steeds lager is dan normaal, plaatst u de vermogensmeter in het optische pad om de bundel te blokkeren. Schakel de APD uit (hierna verwijst APD naar de APD en de enkele fotonentelmodule). Verwijder het monster. Reinig en vervang de objectieflens door een reflecterend doel. Controleer de laserstraal op het reflecterende doel door de vermogensmeter van het lichtpad te verwijderen. Zorg ervoor dat de straal van het doel gecentreerd is en dat de achterreflectie de eerste iris op de lijn bereikt (figuur 3). Zo niet, pas dan de middenpositie aan met M2 of de achterreflectie met de dichroïsche spiegel. Als de microscoopkoppeling correct is, duwt u de objectieflens terug, voegt u een druppel water, een coverslip en een druppel van een meer geconcentreerde Rh6G-oplossing (d.w.z. 200 nM) toe en stelt u een lager laservermogen in dan voor de klassieke metingen (enkele μW). Schakel de APD in en optimaliseer de uitlijning van APD en pinhole, afwisselend, met hun respectieve XYZ-stelschroeven terwijl het intensiteitssignaal wordt bewaakt (LabVIEW-software). Vervang de coverslip en voeg een lagere concentratie Rh6G (2 nM) toe. Beweeg het gaatje langs de Z-as om een positie te vinden waar de moleculaire helderheidsverhouding toeneemt en de taille minimaal is. Sluit de iris totdat het signaal naar beneden valt: de grootte van de laserstraal bereikt de grootte van de achterste opening van het objectief (d.w.z. de minimale tailleomvang, zie Aanvullend materiaal). Start de correlatorsoftware en neem gegevens op (zie rubriek 7 voor gegevensregistratie). Controleer het AKF, dat een lage hoeveelheid ruis moet vertonen, een kleine tailleomvang en een hoge telsnelheid per molecuul per seconde moet geven (zie rubriek 7 voor gegevensanalyse en evaluatie van de tailleomvang). 3. Algemene overwegingen voor de registratie en analyse van svFCS-gegevens Registreer en analyseer de fluorescentiegegevens volgens dit algemene schema (zie secties 7, 8 en 9): (1) fluorescentieregistratie en ACF-generatie (correlatorsoftware), (2) onverwacht weggooien van gegevens, een gemiddelde van bewaarde gegevens, passend bij het juiste model (met zelfgemaakte Igor Pro-software), (3) diffusiewetplot (zelfgemaakte MATLAB-software 1) en (4) optionele diffusiewetgevingsvergelijking (zelfgemaakte MATLAB-software 2). De verschillende softwareprogramma’s zijn op aanvraag beschikbaar.OPMERKING: De hardwarecorrelator heeft een minimale bemonsteringstijd van 12,5 ns (d.w.z. een bemonsteringsfrequentie van 80 MHz). Het biedt een temporele resolutie die minstens 1.000 lager is dan de typische verblijftijd van het vrij diffunderen van kleine moleculen in oplossing en 106 kleiner dan de diffusietijd van membraaneiwitten binnen een confocaal waarnemingsvolume. 4. Celkweek en transfectie Zaai de Cos7-cellen in 8-well chambered coverglass met # 1.0 borosilicaat glazen bodem met een dichtheid van 10.000 cellen / put met behulp van complete Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 U / ml) en L-glutamine (1 mM). Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 24 uur. Verwijder het medium, voeg 300 μL van het verse volledige kweekmedium per put toe en preïncubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C. Verdun 0,5 μg van het plasmide-DNA dat codeert voor Thy-1-eiwit gefuseerd met eGFP25 in 50 μL serumvrije DMEM. Vortex kort om te mengen. Verdun 1,5 μL van het DNA-transfectiereagens in 50 μL serumvrije DMEM en meng de oplossing goed. Voeg het verdunde transfectieregens rechtstreeks toe aan de bereide DNA-oplossing en meng de verbindingen onmiddellijk. Incubeer het bereide mengsel gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 10 μL van de gecombineerde DNA/transfectiereagenstrines druppelsgewijs toe aan het medium in elke put en homogeniseer door de plaat voorzichtig te draaien. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur. Vervang na de incubatie het medium dat DNA/transfectie-reagenscomplexen bevat door 400 μL verse complete DMEM en kweek de cellen gedurende 16 uur vóór het svFCS-experiment. 5. Voorbereiding van cellen voor svFCS-metingen Verwijder het kweekmedium. Was de cellen twee tot drie keer voorzichtig met serumvrije Hank’s balanced salt solution (HBSS) buffer met Ca2+ en Mg2+ aangevuld met 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES). Behoud de cellen in HBSS/HEPES-buffer tijdens alle svFCS-acquisities. 6. Farmacologische behandeling Verwijder het kweekmedium en was de cellen twee tot drie keer met serumvrij HBSS aangevuld met 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES). Incubeer de cellen met 1 U/ml cholesteroloxidase (COase) oplossing in HBSS/HEPES-buffer gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder de oplossing en houd de cellen in de aanwezigheid van 0,1 U/ml COase in HBSS/HEPES-buffer tijdens het uitvoeren van de svFCS-metingen. 7. Kalibratie van spotgrootte Prewarm de microscoopkamer voor op 37 °C. Bereid een standaard 2 nM-oplossing van Rh6G door seriële verdunning. Laat 200 μL 2 nM Rh6G-oplossing vallen op een glazen afdekplaat die op het waterdompelingsobject is geplaatst. Start alle hardware en software. Meet en pas het laserstraalvermogen van 488 nm aan op 300 μW. Afhankelijk van de helderheid en de fotostabiliteit van de gebruikte fluorescentiesonde, past u dit vermogen aan op basis van (1) de fluorescentie-intensiteit (op de LabVIEW-software), die stabiel moet zijn, (2) de ACF-vorm (op de correlatorsoftware), die in de loop van de tijd een constante vorm moet hebben, en (3) de passende parameters die een kleine tailleomvang en een hoge telling per molecuul geven (fotonen per molecuul per seconde, meestal enkele tientallen tot honderden fotonen per molecuul per seconde).OPMERKING: De amplitude van het AKF (G(0) genoemd) is omgekeerd evenredig met het aantal van het molecuul (d.w.z. de concentratie van de fluorescerende sonde). Voor de kalibratie van de tailleomvang is dit een goede kandidaatparameter voor kwaliteitscontrole. Daarom moet G(0) vergelijkbaar zijn voor dezelfde concentratie van dag tot dag, omdat het de tailleomvang en concentratie verbindt. Voor celmetingen, aangezien FCS nauwkeuriger is voor lage concentraties, moet G(0) hoog zijn voor de juiste parameteraanpassingsextractie. Stel de svFCS-verlichtings-/detectiemicroscooppoort in met de LabVIEW-software. Schakel de APD in. Sluit de iris totdat het signaal naar beneden valt om de minimale tailleomvang te verkrijgen, of sluit deze voor een grotere tailleomvang. Noteer verschillende AFC’s van geselecteerde duur (namelijk een run) om de statistische reproduceerbaarheid te verbeteren, meestal 10 runs van elk 20 s met de correlatorsoftware. Schakel de APD uit. Gebruik de Igor Pro-software om de runs met sterke fluctuaties als gevolg van moleculaire aggregaten te controleren en weg te gooien. Voer deze stap handmatig uit- het moet gebruikersonafhankelijk zijn nadat gebruikers zijn getraind. Pas het gemiddelde van de behouden ACL’s aan met een 3D-diffusiemodel. Extraheer uit de aanpassingsparameters de gemiddelde diffusietijd en sla deze op in een “.txt” -bestand (het bestandsformaat wordt bepaald door de Igor Pro-software). Controleer de telsnelheid per molecuul per seconde (een goede prestatie-indicator) door de gemiddelde intensiteit (geëxtraheerd uit het fluorescentiespoor) te delen door het aantal moleculen (geëxtraheerd uit het AKF).OPMERKING: Zorg ervoor dat deze waarde van dag tot dag hoog en stabiel is voor dezelfde acquisitieparameters. Als u de diffusiecoëfficiënt van Rh6G in waterige oplossing bij 37 °C (D) en (zie 7.13) kent, berekent u de experimentele tailleomvang ω volgens: . Pas de procedure toe voor elke wijziging van de tailleomvang die nodig is om de FCS-diffusiewet uit te zetten en vóór elke nieuwe experimentele reeks svFCS-gegevensverzameling. 8. svFCS-gegevensverzamelingen op cellen Meet en pas het straalvermogen van 488 nm aan tussen 2 en 4 μW. Afhankelijk van de helderheid en de fotostabiliteit van de gebruikte fluorescentiesonde, past u dit vermogen aan om een hoge telsnelheid per molecuul mogelijk te maken (meestal enkele duizenden fotonen per molecuul per seconde), terwijl de fotobleaching laag blijft (d.w.z. een stabiel intensiteitsspoor op de LabVIEW-software). Neem monsters gedurende 10 minuten bij 37 °C in evenwicht voordat met de metingen wordt begonnen. Stel de epi-fluorescentieverlichtingsmicroscoop in met de LabVIEW-software. Kies een cel met een geschikte fluorescentieprobecue probelocatie en (lage) fluorescentiesignaalintensiteit.OPMERKING: Hoe lager de fluorescentie is, hoe beter de FCS-metingen zijn (zie stap 8.1). Stel de svFCS-verlichtings-/detectiemicroscooppoort in met de LabVIEW-software. Schakel de APD in. Voer een xy-scan uit van de geselecteerde cel met de LabVIEW-software. Voer een z-scan uit en lokaliseer de confocale plek op de maximale fluorescentie-intensiteit door het plasmamembraan bovenaan te kiezen en de gegevensverzameling te starten. Om de scheiding tussen de twee membranen te maximaliseren, voert u bij voorkeur de scan uit in het nucleaire gebied van de cel. Neem één serie van 20 runs op die 5 s duren, elk met de correlatorsoftware.OPMERKING: Zorg ervoor dat de duur van elke run lang genoeg is om ACF’s met minder ruis te verkrijgen. Lange acquisities zijn gevoelig voor fotobleaching of onverwachte substantiële variaties (bijvoorbeeld aggregaten). Pas het aantal runs, hun duur en het aantal reeksen aan de monsters aan, maar zorg ervoor dat ze constant blijven binnen dezelfde bulk experimenten voor reproduceerbaarheid. Schakel de APD uit. Gooi onverwachte runs weg met de Igor Pro-software. Pas het gemiddelde AKF aan met een 2-soorten 2D-diffusiemodel. Pas dit model aan het type diffusiegedrag van het doelmolecuul aan. Sla de aanpassingsparameters op in het vorige bestand (zie stap 7.13). Voer 10 tot 15 reeksen opnames uit op ten minste 10 verschillende cellen en reproduceer stap 8.3 tot en met 8.13. Controleer of het verkregen enkele bestand de taillegrootte-informatie en de aanpassingsparameters van de 10-15 opnames bevat. Om een enkele diffusiewet vast te stellen, analyseert u ten minste vier taillematen variërend tussen 200 en 400 nm. Dit bereik wordt gedefinieerd door de optische diffractielimiet, maar is objectief- (numeriek diafragma) en laser (golflengte) -afhankelijk.OPMERKING: Omdat de kalibratie van de tailleomvang niet absoluut is en een zekere mate van onzekerheid heeft, is een speciale MATLAB-software28 die rekening houdt met de x- en y-fout (namelijk ω2 en td) gebouwd om te passen bij de diffusiewet. Start de MATLAB-software 1 en selecteer een map met alle “.txt” -bestanden die overeenkomen met ten minste vier experimenten met tailleomvang. Plot <td> versus <ω2>, namelijk de diffusiewet. Er kunnen twee belangrijke parameters worden geëxtraheerd: de y-as intercept (t0) en de effectieve diffusiecoëfficiënt (Deff, omgekeerd evenredig met de helling). 9. Diffusiewetten van verschillende experimentele conditievergelijking OPMERKING: Reproduceer indien nodig secties 7 en 8 voor verschillende experimentele omstandigheden. Er is een speciale software (MATLAB software 2) ontwikkeld om te bepalen of deze diffusiewetten vergelijkbaar zijn of niet volgens de t0- en D-eff-waarden 28. Het test twee hypothesen: de twee waarden zijn verschillend, of de twee waarden zijn niet verschillend bij een drempel die boven een kans op vals alarm (PFA) ligt. Een willekeurige PFA-waarde van 5% (T = 3,8) wordt beschouwd als de bovengrens van significantie tussen twee parameters (t0 of Deff), wat aangeeft dat er slechts 5% kans is dat de twee waarden identiek zijn. Maak een “.xls”-bestand met de karakteristieke diffusiewetwaarden van elke voorwaarde om te vergelijken (d.w.z. een bestand met de t0, t0-fout , Deff en Deff-fout voor de niet-behandelde (NT) en behandelde (COase) voorwaarden als een tabel). Start de MATLAB-software 2. Selecteer het bestand “.xls”. Analyseer de gegenereerde kleurgecodeerde 2D-plot, waarbij de statistische tests t0 en Deff moeten worden uitgezet op respectievelijk de x- en y-as (figuur 4). Hoe hoger T is, hoe groter het verschil tussen de vergeleken waarden. 10. Cholesterolconcentratiemetingen Celbehandeling en lysis Zaai de Cos7-cellen in drievoud in 6-well platen op 4 × 105 cellen / put en incubeer in 2 ml volledige DMEM bij 37 ° C met 5% CO2 ‘s nachts om de cellen aan de plaat te laten hechten. Verwijder het kweekmedium en was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 ml HBSS/HEPES-buffer toe die (of niet, voor controles) 1 U/ml coase bevat en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium door 1 ml HBSS/HEPES met 0,1 U/ml coase en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met 5% CO2. Verwijder de oplossing en oogst de cellen. Was de cellen drie keer met PBS en centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Lyse de cellen met radioimmunoprecipitatietestbuffer (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM ethyleendiamine tetraazijnzuur, 2% glycerol, protease en fosfataseremmer cocktail) gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten bij 10000 × g gedurende 10 min bij 4 °C en verzamel het supernatant. Kwantificeer de totale eiwitconcentratie voor elk monster door de eiwittest van Bradford te wijzigen met behulp van de werkoplossing volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Cholesterolconcentratie meten Om het totale cellulaire cholesterolgehalte enzymatisch te bepalen, gebruikt u de juiste kit (bijv. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Meng voor elke reactie het monster dat 5 μg eiwit bevat met Amplex Red-reagens/mierikswortelperoxidase/cholesteroloxidase/cholesterolesterase-werkoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker. Meet de fluorescentie met behulp van excitatie van 520 nm en detecteer de emissie bij 560-590 nm met behulp van een microplaatlezer. Trek de achtergrond af van de eindwaarde en bepaal de cholesterolconcentratie met behulp van een standaardcurve. Bereken het uiteindelijke cholesterolgehalte in ng cholesterol per μg eiwit.

Representative Results

We genereerden een DL voor Thy1-GFP uitgedrukt in Cos-7 cellen (Figuur 4, zwarte vierkanten). De diffusiewet heeft een positieve t0-waarde (19,47 ms ± 2 ms), wat aangeeft dat Thy1-GFP is opgesloten in nanodomeinstructuren van het plasmamembraan. De cholesteroloxidasebehandeling van de cellen die Thy1-GFP tot expressie brengen, resulteerde in de verschuiving van de DL t0-waarde naar 7,36 ± 1,34 ms (figuur 4, grijze vierkanten). Deze observatie bevestigt dat de aard van Thy1-GFP-opsluiting afhankelijk is van het cholesterolgehalte en geassocieerd is met lipidevlot nanodomeinen. Deze twee diffusiewetten blijken volgens de hierboven beschreven statistische test (zie stap 9.1.3) verschillend te zijn in termen van t0- en D-eff-waarden. Daarnaast beoordeelden we de concentratie van totaal cellulair cholesterol in niet-behandelde Cos-7-cellen versus de cellen behandeld met COase. Een kleine, maar significante daling van het totale cholesterolgehalte wordt waargenomen bij behandeling met COase (figuur 5). Omdat dit enzym alleen inwerkt op de cholesterolpool die toegankelijk is in de buitenste folder van het plasmamembraan, gaan we ervan uit dat de waargenomen daling van cholesterol alleen geassocieerd is met het plasmamembraan en resulteert in de destabilisatie van lipidevlot nanodomeinen. Figuur 1: Gesimuleerde fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) diffusiewetten vastgesteld door spot-variatie FCS voor verschillende vormen van membraanorganisatie. (Bovenste panelen) Schematische weergave van membraanorganisatie – (A) vrije diffusie, (B) meshwork-barrières en (C) val / domeinopsluitingen – met het traject getekend voor een enkel molecuul (rood). Blauwe cirkels geven de kruising van het membraan en de laserstraal van taille ω aan. (Onderste panelen) FCS-diffusiewetten weergegeven door de diffusietijd td uit te zetten als een functie van de kwadraatstraal ω2. Diffusiewetprojectie (groene stippellijn) onderschept de tijdas op (A) de oorsprong (t0 = 0) in het geval van vrije diffusie; B) in de negatieve as (t0 < 0) wanneer er mazenbarrières zijn, of (C) in de positieve as (t0 > 0) wanneer er vallen en domeinen zijn (lipidevlotten). D is de laterale diffusiecoëfficiënt voor Brownse beweging; Deff, de effectieve diffusiecoëfficiënt; Dmicro, de microscopische diffusiecoëfficiënt in de maaswerkvallen; Din, de diffusiecoëfficiënt binnen domeinen; Duit, de diffusiecoëfficiënt buiten domeinen; L, de grootte van de zijde van een vierkant domein; en rD, de straal van een cirkelvormig domein. Deze figuur is aangepast van He en Marguet6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Schematische weergave van svFCS-hardwarebesturing. De computer bestuurt alle apparaten via verschillende communicatieprotocollen: serieel (microscoop, externe sluiter), USB (XYZ piëzo-elektrische fase, correlator) en PCI (acquisitiebord). DAQ: data-acquisitiebord, APD: lawinefotodiode, SPCM: enkele fotonentelmodule, DO: digitale uitvoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schematische weergave van excitatie- en emissie-optische paden van de svFCS-opstelling. De svFCS-opstelling bevat vier modules: (1) de output van een vezelige 488 nm-laser wordt gecollimeerd, (2) een combinatie van een halve golfplaat en polariserende bundelsplitser stelt het optische vermogen in, (3) de laserstraal gericht op het monster na het reizen door een buislensvrije gemotoriseerde microscoop, en (4) de fluorescentie wordt gedetecteerd via een confocal-achtig detectiepad op een lawinefotodiode gekoppeld aan een enkele fotonentelmodule, die een signaal levert aan een hardwarecorrelator. Eenvoud geeft het systeem zijn gevoeligheid, robuustheid en gebruiksgemak (veel becommentarieerd in aanvullend materiaal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: De svFCS-diffusiewetten gegenereerd uit diffusieanalyse van Thy1-GFP uitgedrukt in Cos-7. svFCS diffusiewetten van Cos-7 cellen zonder behandeling (NT, zwarte vierkanten) en na behandeling met cholesteroloxidase (COase, grijze cirkels). De insert in de grafiek vertegenwoordigt statistische testen van een significant verschil tussen de twee gepresenteerde svFCS-diffusiewetten (volgens Mailfert et al.28). De testwaarde (T) moet hoger zijn dan de drempel van 3,8 wanneer beide diffusiewetten verschillend zijn. Hoe hoger het is, hoe groter het verschil tussen de diffusiewetten. De waarde van T is kleurgecodeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Vergelijking van het totale cholesterolgehalte in Cos-7-cellen. Cos-7-cellen werden ofwel niet-behandeld (NT) of behandeld met 1 U /ml cholesteroloxidase (COase) gedurende 1 uur. De gegevens zijn een voorbeeld van één experiment in drievoud. Een tweezijdige, ongepaarde t-test werd gebruikt om het statistische verschil te beoordelen (α = 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel met materialen: De lijst met optische elementen die nodig zijn voor de svFCS-installatie. Aanvullend materiaal: Dit document beschrijft het bouwen van een svFCS-opstelling vanaf nul. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Hier hebben we de implementatie van de svFCS-module op een standaard fluorescerende microscoop beschreven, een krachtige experimentele benadering om de dynamiek van de plasmamembraanorganisatie in levende cellen te ontcijferen dankzij de FCS-diffusiewetanalyse. Conceptueel is de svFCS gebaseerd op een eenvoudig principe: correlatiemetingen van fluorescentie in het tijdsdomein, terwijl de grootte van het verlichtingsgebiedvarieert 23. Deze strategie is instrumenteel geweest bij het afleiden van nanoscopische informatie uit microscopische metingen, die helpt bij het ontcijferen van de belangrijkste fysisch-chemische elementen die bijdragen aan de plasmamembraanorganisatie in steady state25 en fysiologische processen 30,31,32,33. Al met al tonen deze svFCS-analyses ondubbelzinnig het bestaan aan van lipide-afhankelijke nanodomeinen in verschillende celtypen en hun directe implicatie bij het afstemmen van verschillende signaleringsgebeurtenissen.

Binnen dit kader zijn er enkele optische aspecten waarmee rekening moet worden gehouden bij het bouwen van de svFCS-opstelling om het fotonenbudget te optimaliseren en optische aberraties te minimaliseren. Daarom raden we aan een microscoop te gebruiken waaruit de buislens kan worden verwijderd wanneer de svFCS-meting wordt uitgevoerd. Bovendien speelt een enkele iris een sleutelrol in de svFCS-opstelling: het verandert de straalgrootte bij de achterste opening van het objectief, waardoor de effectieve tailleomvang (d.w.z. het effectieve excitatievolume) direct varieert. De balkdiameter moet passen bij de achterste pupil van het objectief om de kleinste taillemaat34 te verkrijgen. Deze optie, die helpt bij het afstemmen van de tailleomvang, zorgt voor optimalisatie van het fotonenbudget en is eenvoudig te implementeren. Ten slotte wordt een minimaal aantal optische onderdelen gebruikt langs het lichtpad; hoe minder complex het systeem, hoe minder fotonen er verloren gaan. Al deze opties verbeteren de robuustheid van svFCS-experimenten aanzienlijk.

Met betrekking tot het protocol zelf moeten een paar kritische stappen worden overwogen. Het belangrijkste is een passende uitlijning van de optische paden die cruciaal is voor succesvolle svFCS-metingen (protocol, paragraaf 2). Dit is eenvoudig te controleren door het fluorescentiesignaal van een 2 nM Rh6G-oplossing te analyseren, die ~ 200 kHz onder 300 μW laserverlichting zou moeten zijn. Alle irissen moeten worden geopend en de ACF’s moeten een belangrijke amplitude hebben (meestal G0 ~ 1,5-2,0). Een ander kritiek punt betreft de cellen en hun voorbereiding op svFCS-analyse (protocol, secties 4-8). Hun dichtheid moet worden aangepast, zodat geïsoleerde cellen die moeten worden waargenomen, beschikbaar zijn voor analyse. Niet-hechtende cellen moeten worden geïmmobiliseerd op een kamerglas met behulp van poly-L-lysine-oplossing. Het fluorescentiesignaal van celetikettering mag niet te sterk zijn, anders zal het resulteren in zeer platte ACF’s die moeilijk te passen zijn, en de fitparameters worden belast met een belangrijke fout. Bovendien maken niet-homogene etiketterings- en fluorescentieaggregaten in cellen de svFCS-metingen uiterst moeilijk te interpreteren. Ten slotte beïnvloedt de behandeling met cholesteroloxidase de levensvatbaarheid van de cellen en mag de svFCS-analyse niet langer dan een uur na de behandeling plaatsvinden. Het is ook beter om de fluorescentiefluctuaties van het bovenste plasmamembraan te registreren, omdat het niet aan de ondersteuning is bevestigd en er geen risico is op belemmerde diffusie van moleculen als gevolg van de fysieke interacties met de ondersteuning.

Er is voldoende vooruitgang geboekt in de svFCS-techniek voor het gebruik ervan in verschillende benaderingen vanwege de diversiteit aan modaliteiten voor het aanpassen van het detectievolume, waardoor het mogelijk is om verschillende biologische processen in levende cellen te bestuderen. Een alternatief voor het aanpassen van de grootte van het excitatievolume is het gebruik van een variabele bundelexpander35. Het is ook mogelijk om eenvoudig de grootte van het verlichtingsgebied te moduleren door het fluorescerende signaal van de onderschepping van het plasmamembraan langs de z-richting36 te registreren. Dit kan op een standaard confocale microscoop waarvoor een theoretisch kader is ontwikkeld om de diffusiewet af te leiden37,38.

Hoewel de svFCS-methode spatio-temporele resolutie biedt, die nodig is voor de karakterisering van de inhomogene laterale organisatie van het plasmamembraan, sluiten de geometrische manieren van opsluiting elkaar niet uit. Een afwijking van t0 in de ene of de andere richting onthult uitsluitend een dominante manier van opsluiting25. Bovendien is een andere belangrijke beperking van de huidige svFCS-methode het gevolg van de klassieke optische diffractielimiet (~ 200 nm). Dit is ongetwijfeld groter dan de domeinen die de moleculen in het celplasmamembraan beperken. Daarom wordt de analyse van de opsluiting afgeleid uit de t 0-waarde, geëxtrapoleerd uit de diffusiewet.

Dit nadeel is overwonnen door alternatieve methoden te implementeren. Aanvankelijk bood het gebruik van metalen films geboord met nanoapertures de mogelijkheid om een zeer klein membraanoppervlak te verlichten (d.w.z. onder de optische diffractielimiet van enkele nanometrische openingen van radii variërend tussen 75 en 250 nm)39. Het overgangsregime voorspeld op basis van de theoretische diffusiewet voor geïsoleerde domeinorganisatie werd dus gerapporteerd, en het maakte een verfijning mogelijk van de karakteristieke grootte van de nanometrische membraanheterogeniteiten en een kwantitatieve schatting van het oppervlak bezet door lipide-afhankelijke nanodomeinen39. Als alternatief is nanometrische verlichting ook ontwikkeld met behulp van near-field scanning optische microscopie40 of planaire optische nanoantennas41. Meer recent heeft het combineren van gestimuleerde emissiedepletie (STED) en FCS een krachtig en gevoelig hulpmiddel geboden om de diffusiewet met een zeer hoge ruimtelijke resolutie te documenteren. Deze STED-FCS geeft toegang tot moleculaire diffusiekenmerken op nanoschaal die binnen een korte tijdsperiode plaatsvinden, waardoor de dynamische organisatie van lipidensondes op het plasmamembraan42,43 kan worden bestudeerd. De onvolledige onderdrukking van fluorescentie in het SOA-proces daagt echter de analyse van de autocorrelatiecurven in FCS uit.

Er is een nieuw pasmodel ontwikkeld om deze moeilijkheid te overwinnen en de nauwkeurigheid van de diffusietijden en gemiddelde molecuulaantallen te verbeteren44. Ten slotte kan voor langzame moleculaire diffusie op het plasmamembraan het svFCS-principe worden toegepast op gegevens die zijn geregistreerd door beeldcorrelatiespectroscopie45. Onlangs is aangetoond dat het combineren van atoomkrachtmicroscopie (AFM) met beeldvorming totale interne reflectie-FCS (ITIR-FCS) bijdraagt aan de verfijning van de aard van het mechanisme dat moleculaire diffusie op het plasmamembraan belemmert, vooral in de buurt van de percolatiedrempelmembraanconfiguratie vanwege een hoge dichtheid van nanodomeinen46.

Concluderend heeft het vaststellen van de diffusiewet door svFCS het experimentele bewijs geleverd om lokale heterogeniteit af te leiden die is gecreëerd door dynamische collectieve lipiden- en membraaneiwitassociaties. Zoals Wohland en collega’s46 stelden, “blijft de FCS-diffusiewetanalyse een waardevol hulpmiddel om structurele en organisatorische kenmerken onder de resolutielimiet af te leiden uit dynamische informatie”. Toch moeten we nieuwe modellen ontwikkelen om de interpretatie van de diffusiewet te verfijnen die een beter begrip mogelijk moet maken van de dynamiek van de moleculaire gebeurtenissen die zich voordoen op het plasmamembraan.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SB, SM en DM werden ondersteund door institutionele financiering van de CNRS, Inserm en Aix-Marseille University en programmasubsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR-17-CE15-0032-01 en ANR-18-CE15-0021-02) en het Franse “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW erkent “BioTechNan”, een programma van interdisciplinaire milieudoctorale studies KNOW op het gebied van biotechnologie en nanotechnologie. EB erkent de financiële steun van het National Science Centre of Poland (NCN) in het kader van project nr. 2016/21/D/NZ1/00285, evenals de Franse regering en de ambassade van Frankrijk in Polen. MŁ erkent de financiële steun van het Poolse ministerie van Ontwikkeling (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) en het Nationaal Centrum voor Onderzoek en Ontwikkeling (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT erkent financiële steun van het National Science Center of Poland (NCN) in het kader van project nr. 2016/21/B/NZ3/00343 en van het Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

Materials

Aligment tool Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings Thorlabs SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode Excelitas SPCM-AQRH-15
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m RS Components 742-4315
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 RS Components 885-8172
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz RS Components 546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V RS Components 768-5500
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C RS Components 452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter RS Components 792-4079
Fluorescence filtering 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm AHF filter F47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm AHF filter F43-088
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 AHF filter F37-496
Hardware correlator 80 MHz Digital Correlator Correlator.com Flex02-12D
Laser LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW Lasos BLD-XT 488100
Laser safety High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll Thorlabs T743-2.0
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets Thorlabs MC-5
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission Thorlabs LG3B
Microscope Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope
Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters		 Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS
(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR		 Carl Zeiss 421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-345
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-347
Optical path D25.4mm Mirror, Protected Silver Thorlabs PF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-035-A
25 µm mounted pinhole Thorlabs P25S I
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm Thorlabs WPH10M-488 (HWP)
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm Thorlabs PBS201
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID Thorlabs RSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount Thorlabs KM100B/M
Adjustable Prism Clamp Thorlabs PM3/M
Beam block – active area 19 mm x 38 mm Thorlabs LB1/M
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture Thorlabs ID25/M
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount Thorlabs KM100CL
1" Optic Holder, M4 Tap Thorlabs MFF101/M
1" Stackable Lens Tube Thorlabs SM1L03
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ Thorlabs SM1L05
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" Thorlabs SM1L20
Small Optical Rails 600mm, metric Thorlabs RLA600/M
Small Optical Rails 75mm, metric Thorlabs RLA075/M
Small Optical Rails 150mm, metric Thorlabs RLA150/M
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" Thorlabs RC1
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail Thorlabs RC3
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch Thorlabs LM1XY/M
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage Thorlabs DT12/M
Rail Clamps Thorlabs CL6
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) Thorlabs PT3/M
Black Rubberized Fabric Thorlabs BK5
Ball Driver kit/ 6 tools Thorlabs BD-KIT/M
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads Thorlabs AP6M4M
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack Thorlabs BA1S/M-P5
Lens Mount for 25.4mm optic Thorlabs LMR1/M
SM1 FC/APC Adapter Thorlabs SM1FCA
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics Thorlabs KM100
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW Thorlabs S120C
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,
L=50 mm, 5 Pack		 Thorlabs PH50/M-P5
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm Thorlabs PH20/M
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR50/M-P5
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR75/M-P5
USB Power and Energy Meter Interface Thorlabs PM100USB
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR30/M
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR20/M
750 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L750/M
350 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L350/M
Quick Corner Cube for 25 mm Rails Thorlabs XE25W3
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails Thorlabs XE25A90
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets Thorlabs TB5
Hinge for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25H
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25LS
M4 Cap Screw Kit Thorlabs HW-KIT1/M
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit Thorlabs HW-KIT2/M
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack Thorlabs CL5-P5
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) Thorlabs SM1D12D
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole Thorlabs DG10-1500-H1-MD
Honeycomb Optical Table Top, Standa Standa 1HB10-15-12
Optical Table support, Standa Standa 1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning Precision XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V
Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,		 Physik Instrumente PI E727-3.CD
Temperature chamber Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK Digital Pixel
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller Digital Pixel DP_MTC_2000_DUO
Two Vibration Free Heater Modules Digital Pixel DP_150_VF
PT100 Temperature Sensor Digital Pixel DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection Cos7 cells ATCC® CRL-1651™
8- well Lab-Tek chambers Thermo Fisher Scientific 155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
PBS buffer Thermo Fisher Scientific 14190144
PenStrep Thermo Fisher Scientific 15140122
PolyJet Transfection Reagent SignaGen Laboratories SL100688
Cholesterol content measurement Amplex Red Cholesterol Assay Kit Thermo Fisher Scientific A12216
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 87786
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78420
ROTI Nanoquant Working Solution Roth K880
GloMax Discover Microplate Reader Promega GM3000
svFCS measurements HBSS buffer Thermo Fisher Scientific 14025092
Hepes buffer Thermo Fisher Scientific 15630080
Cholesterol oxidase Sigma-Aldrich C8868
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 83697-1G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, 361-371 (2003).
  3. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
  4. Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
  6. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
  7. Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
  8. Nicolson, G. L. The Fluid – Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
  9. Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
  10. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
  11. Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
  12. Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
  13. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
  14. Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
  15. Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
  16. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
  17. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
  18. Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
  19. Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
  20. Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
  21. Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
  22. Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
  23. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  24. Saxton, M. J. Fluorescence corralation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2005).
  25. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  26. Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
  27. Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
  28. Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user’s guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
  29. Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. , (2006).
  30. Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
  31. Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21 (2011).
  32. Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
  33. Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
  34. Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
  35. Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
  36. Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
  37. Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
  38. Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
  39. Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
  40. Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
  41. Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
  42. Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
  43. Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
  44. Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
  45. Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
  46. Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).

Tags

Spot Variation Fluorescence Correlation SpectroscopyMolecular DiffusionPlasma MembraneLiving CellsConfocal MicroscopyLaser PowerRhodamine 6GAuto Correlation FunctionDiffusion TimeSvFCS AnalysisXY ScanZ Scan

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mailfert, S., Wojtowicz, K., Brustlein, S., Blaszczak, E., Bertaux, N., Łukaszewicz, M., Marguet, D., Trombik, T. Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells. J. Vis. Exp. (165), e61823, doi:10.3791/61823 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image