Bildbehandling och analys av neurofilament transport i struket Mus Tibial Nerve

Den axonal transport av neurofilaments först visades på 1970-talet genom radioisotopisk puls-märkning¹. Detta tillvägagångssätt har gett en mängd information om neurofilament transport in vivo, men det har relativt låg rumslig och tidsmässig upplösning, typiskt på storleksordningen millimeter och dagar i bästa^{fall 2}. Dessutom är radioisotopisk pulsmärkning en indirekt metod som kräver injektion och uppoffring av flera djur för att generera en enda tidskurs. Med upptäckten av fluorescerande proteiner och framsteg i fluorescensmikroskopi på 1990-talet, blev det därefter möjligt att bilden neurofilament transport direkt i odlade nervceller på en tidsskala av sekunder eller minuter och med sub-mikrometer rumslig upplösning, vilket ger mycket större insikt i mekanismen för rörelse³. Dessa studier har visat att neurofilament polymerer i axoner rör sig snabbt och periodvis i både anterograde och bakåtsträvande riktningar längs mikrotubuli spår, drivs av mikrotubuli motorproteiner. Emellertid, neurofilaments är diffraktion-begränsade strukturer bara 10 nm i diameter som vanligtvis är fördelade bortsett från sina grannar av endast tiotals nanometer; därför kan polymererna endast spåras i odlade nervceller som innehåller glest fördelade neurofilament så att de rörliga polymererna kan lösas från sina grannar⁴. Det är alltså för närvarande inte möjligt att spåra enstaka neurofilament i axoner som innehåller rikliga neurofilament polymerer, såsom myelinerade axoner.

För att analysera axonal transport av neurofilaments i neurofilament-rika axoner med hjälp av fluorescensmikroskopi, använder vi en fluorescens fotoaktivering puls-escape metod som vi utvecklat för att studera den långsiktiga pausa beteende neurofilaments i odlade nervceller^4,5. Neurofilaments taggade med en photoactivatable fluorescerande neurofilament fusion protein aktiveras i ett kort segment av axon, och sedan graden av avgång av dessa glödtrådar från den aktiverade regionen kvantifieras genom att mäta fluorescens sönderfall över tiden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det är en analys på befolkningsnivå av neurofilamenttransport som kan appliceras på en tidsskala av minuter eller timmar utan att behöva spåra förflyttning av enskilda neurofilamentpolymerer. Till exempel har vi använt denna metod för att analysera kinetiken hos neurofilamenttransport i myelinerande kulturer⁶.

Nyligen beskrev vi utvecklingen av en hThy1-paGFP-NFM transgen mus som uttrycker låga nivåer av en paGFP-taggade neurofilament protein M (paGFP-NFM) i nervceller under kontroll av den mänskliga neuron-specifika Thy1 promotorn⁷. Denna mus tillåter analys av neurofilament transport in situ med hjälp av fluorescens mikroskopi. I den här artikeln beskriver vi de experimentella tillvägagångssätt för att analysera neurofilament transport i myelinated axoner av tibial nerver från dessa möss med hjälp av två tillvägagångssätt. Den första av dessa tillvägagångssätt är puls-escape-metoden som beskrivs ovan. Denna metod kan generera information om neurofilamentens pausande beteende, men är blind för den riktning i vilken glödtrådarna avgår den aktiverade regionen, och tillåter därför inte mätning av nettore riktadhet och transporthastighet⁸. Den andra av dessa metoder är en ny pulsspridningsmetod där vi analyserar inte bara förlusten av fluorescens från den aktiverade regionen, utan också den övergående ökningen av fluorescens i två flankerande fönster genom vilka de fluorescerande glödtrådarna rör sig när de avgår den aktiverade regionen i både anterograde och bakåtsträvande riktningar. I båda inflygningarna kan parametrar för neurofilamenttransport som den genomsnittliga hastigheten, nettore riktadhet och pausningsbeteende erhållas genom att använda matematisk analys och modellering av förändringarna i fluorescensen i mätrutorna. Bild 3 illustrerar dessa två tillvägagångssätt.

Detta protokoll visar dissekering och förberedelse av nerv, aktivering och bildframställning av paGFP fluorescens, och kvantifiering av neurofilament transport från de förvärvade bilderna med hjälp av FIJI distributionspaket av ImageJ⁹. Vi använder tibialnerven eftersom den är lång (flera cm) och förgrenar oss inte; dock i princip någon nerv uttrycker paGFP-NFM är lämpligt för användning med denna teknik om det kan dissekeras och de-mantlade utan att skada axoner.