切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

ニューロフィラメントの軸索輸送は、1970年代にラジオアイソトピックパルス標識¹によって初めて実証された。このアプローチは 、インビボでのニューロフィラメント輸送に関する豊富な情報を生み出したが、空間的および時間的解像度が比較的低く、通常はミリメートルと最高の日の順序で^2.また、ラジオアイソトピックパルス標識は、単一の時間経過を生成するために複数の動物の注入と犠牲を必要とする間接的なアプローチです。1990年代に蛍光タンパク質の発見と蛍光顕微鏡の進歩により、その後、培養ニューロン内のニューロフィラメント輸送を数秒または数分の時間スケールで直接画像化し、マイクロメートル以下の空間分解能を用いて、動きのメカニズムに関するより大きな洞察を得る^{ようになりました3。}これらの研究は、軸索中のニューロフィラメントポリマーが微小管運動タンパク質によって推進される微小管トラックに沿って前向きおよび逆行方向の両方で迅速かつ断続的に移動することを明らかにした。しかし、ニューロフィラメントは直径わずか10nmの回折限定構造であり、通常は数十ナノメートルの間だけ隣人と離れている。したがって、ポリマーは、移動ポリマーが隣人から解決できるように、まばらに分布した神経フィラメントを含む培養ニューロン内でのみ追跡することができる^4。したがって、現在では、ミエリン軸索のような豊富なニューロフィラメントポリマーを含む軸索中の単一の神経フィラメントを追跡することは不可能である。

蛍光顕微鏡を用いた神経フィラメント豊富軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析するために、培養神経細胞^,4,5における神経フィラメントの長期休止挙動を研究するために開発した蛍光光活性化パルスエスケープ法を用いた。⁴光活性化可能な蛍光ニューロフィラメント融合タンパク質でタグ付けされたニューロフィラメントは、軸索の短いセグメントで活性化され、その後、活性化領域からのそれらのフィラメントの出発速度は、時間の経過に伴う蛍光の減衰を測定することによって定量化されます。このアプローチの利点は、個々のニューロフィラメントポリマーの動きを追跡することなく、数分または数時間の時間スケールで適用することができるニューロフィラメント輸送の集団レベルの分析であるということです。例えば、この方法を用いて、ミエリン化培養6におけるニューロフィラメント輸送の運動を^{分析した。}

最近、ヒトニューロン特異的Thy1プロモーター⁷の制御下にあるニューロンにおいて、paGFPタグ付きニューロフィラメントタンパク質M(paGFP-NFM)の低レベルを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスの開発について説明した。このマウスは蛍光顕微鏡を用いたその場所でのニューロフィラメント輸送の分析を可能にする。本稿では、2つのアプローチを用いて、これらのマウスから脛骨神経のミエリン軸索におけるニューロフィラメント輸送を分析するための実験的アプローチについて述べた。これらのアプローチの最初は、上記のパルスエスケープ方式です。この方法は、ニューロフィラメントの一時停止挙動に関する情報を生成することができるが、フィラメントが活性化領域を出発する方向に盲目であり、したがって正味方向および輸送速度⁸の測定を可能にしない。第2のアプローチは、活性化領域からの蛍光の損失だけでなく、蛍光フィラメントが前向きおよび逆行方向の両方で活性化領域を出発する際に蛍光が移動する2つの側面窓における蛍光の一過性増加を分析する新しいパルス拡散法である。どちらのアプローチでも、測定窓における蛍光変化の数学的分析とモデリングを用いて、平均速度、正味方向性および一時停止行動などのニューロフィラメント輸送のパラメータを得ることができる。 図 3 は、これら 2 つのアプローチを示しています。

このプロトコルは、神経の解剖および調製、paGFP蛍光の活性化および画像化、およびImageJ⁹のFIJI配布パッケージを用いて取得した画像からのニューロフィラメント輸送の定量を示す。それは長い(数cm)であり、分岐しないので、私たちは脛骨神経を使用します。しかし、原理的にpaGFP-NFMを発現する神経は、軸索を損傷することなく解剖し脱整えることができる場合、この技術で使用するのに適している。