切除小鼠神经神经纤维神经丝的成像与分析

神经丝的电弓传输在20世纪70年代首次通过放射性同位素脉冲标记^{1进行证明}。这种方法已经产生了大量有关神经丝在体内传输 的信息，但它具有相对较低的空间和时间分辨率，通常以毫米和天的顺序，充其量^2。此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射和牺牲多个动物来生成一个时间过程。随着荧光蛋白的发现和荧光显微镜在20世纪90年代的进步，它随后成为可能在培养神经元中直接成像神经丝传输的时间尺度为秒或分钟，并具有亚微米的空间分辨率，提供了对^{运动3机制的更深入的了解}。这些研究表明，轴子中的神经细合聚合物在微管运动蛋白的推动下，在反风和逆行方向上快速、间歇性地移动。然而，神经丝是衍射受限的结构，直径只有10纳米，通常与邻居相距只有几十纳米;因此，聚合物只能在含有稀疏分布神经丝的培养神经元中进行跟踪，以便移动的聚合物可以从其邻居^4中解析。因此，目前无法跟踪轴子中含有大量神经丝聚合物的单一神经丝，如骨髓轴。

为了利用荧光显微镜分析神经细细轴的轴向，我们采用荧光活化脉冲-逃逸法，研究培养神经细胞^4、5,中神经丝的长期暂停^行为。标有光激活荧光神经丝融合蛋白的神经丝在轴孔的一小段中激活，然后通过测量荧光衰变来量化这些丝从激活区域的离开速度。这种方法的优点是，它是神经丝传输的人口级分析，可以在几分钟或数小时的时间尺度上应用，而无需跟踪单个神经丝聚合物的运动。例如，我们用这种方法来分析骨髓培养物⁶中神经丝体传输的动力学。

最近，我们描述了一个hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠的发展，它表示在人类神经元特异性Thy1启动子7的控制的神经元中，paGFP标记神经丝蛋白M（paGFP-NFM）的^低水平。此小鼠允许使用荧光显微镜分析神经丝在原位传输。在这篇文章中，我们描述了用两种方法分析这些小鼠骨髓神经轴子神经纤维素的神经丝传输的实验方法。其中第一种方法是上述脉冲转义方法。此方法可以生成有关神经丝的暂停行为的信息，但对细丝离开激活区域的方向视而不见，因此不允许测量净方向性和传输速度⁸。第二种方法是一种新的脉冲传播方法，我们不仅分析来自激活区域的荧光损失，而且分析两个侧翼窗口中荧光的瞬态增加，荧光丝在离开激活区域时在逆行和逆行方向上移动。在这两种方法中，通过数学分析和测量窗口荧光变化的建模，可以获得神经丝传输参数，如平均速度、净方向性和暂停行为。 图 3说明了这两种方法。

该协议演示了神经的解剖和准备，paGFP荧光的激活和成像，以及使用 ImageJ⁹的FIFI分布包从获得的图像中对神经丝传输的定量。我们使用三元神经，因为它是长（几厘米），不分支;然而，原则上，任何神经表达paGFP-NFM是适合与这种技术，如果它可以解剖和脱套而不损害轴子。