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Neurociência

Un enfoque de sobremesa para la ubicación específica de la barrera hematoencefálica que se abre con ultrasonido enfocado en un modelo de rata

Published: June 13, 2020
doi:
10.3791/61113
, , ,
1Department of Radiology,University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology,University of Alabama at Birmingham

Summary

El ultrasonido enfocado con agentes de microburbuja puede abrir la barrera hematoencefálica de forma focal y transitoria. Esta técnica se ha utilizado para entregar una amplia gama de agentes a través de la barrera hematoencefálica. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la entrega localizada al cerebro de roedores con o sin orientación de RMN.

Abstract

La cirugía estereotáxica es el estándar de oro para la administración localizada de fármacos y genes en el cerebro de roedores. Esta técnica tiene muchas ventajas sobre la entrega sistémica, incluyendo la localización precisa a una región cerebral objetivo y la reducción de los efectos secundarios fuera del objetivo. Sin embargo, la cirugía estereotáxica es altamente invasiva que limita su eficacia traslacional, requiere largos tiempos de recuperación y proporciona desafíos cuando se dirige a múltiples regiones cerebrales. El ultrasonido enfocado (FUS) se puede utilizar en combinación con microburbujas circulantes para abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica (BBB) en regiones del tamaño de un milímetro. Esto permite la localización intracraneal de agentes entregados sistémicamente que normalmente no pueden cruzar el BBB. Esta técnica proporciona una alternativa no invasiva a la cirugía estereotáxica. Sin embargo, hasta la fecha esta técnica aún no ha sido ampliamente adoptada en los laboratorios de neurociencia debido al acceso limitado a equipos y métodos estandarizados. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB (BBBO) que sea asequible y reproducible y, por lo tanto, pueda ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio.

Introduction

A pesar de los muchos descubrimientos en neurociencia básica, el número de tratamientos emergentes para trastornos neurodesarrollo y neurodegenerativos sigue siendo relativamente limitado1,2. Una comprensión más profunda de los genes, moléculas y circuitos celulares involucrados en trastornos neurológicos ha sugerido tratamientos prometedores irrealizables en los seres humanos con técnicas actuales3. Los tratamientos eficaces a menudo están limitados por la necesidad de ser penetrables en el cerebro y específicos del sitio4,5,6,7,8. Sin embargo, los métodos existentes de administración localizada de fármacos en regiones cerebrales específicas (por ejemplo, la administración mediante inyección o cánula) son invasivos y requieren una abertura que se debe hacer en el cráneo9. La invasión de esta cirugía impide el uso rutinario del parto localizado en el cerebro humano. Además, el daño tisular y las respuestas inflamatorias resultantes son confundaciones omnipresentes para estudios básicos y preclínicos que se basan en la inyección intracerebral10. La capacidad de entregar agentes no invasivas a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y dirigirse a regiones cerebrales específicas podría tener un tremendo impacto en los tratamientos para trastornos neurológicos, al mismo tiempo que proporciona una poderosa herramienta de investigación para la investigación preclínica.

Un método de transporte dirigido a través del BBB con daño mínimo en el tejido es el ultrasonido centrado transcraneal (FUS) junto con microburbujas para abrir focal y transitoriamente el BBB11,12,13,14,15,16. Fus BBB apertura ha ganado atención reciente para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, accidente cerebrovascular y glioma mediante la localización de terapias para dirigirse a regiones cerebrales como factores neurotróficos17,18,19,terapias génicas20,21,22,anticuerpos23,neurotransmisores24,y nanopartículas25,26,27,28,29. Con su amplia gama de aplicaciones y su naturaleza no invasiva30,31,la apertura FUS BBB es una alternativa ideal a las inyecciones intracraneales estereotáxicas rutinarias. Además, debido a su uso actual en humanos30,32,investigaciones preclínicas utilizando esta técnica pueden considerarse altamente traslacionales. Sin embargo, la apertura de FUS BBB aún no ha sido una técnica ampliamente establecida en ciencia básica e investigación preclínica debido a la falta de accesibilidad. Por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado para un enfoque de sobremesa para la apertura de FUS BBB como punto de partida para los laboratorios interesados en establecer esta técnica.

Estos estudios se llevaron a cabo con un transductor de ultrasonido específico FUS de respaldo de aire de alta potencia o un transductor de inmersión ultrasónico enfocado en amortiguación de baja potencia. Los transductores fueron impulsados por un amplificador de potencia de RF diseñado para cargas reactivas y un generador de funciones de sobremesa estándar. Los detalles de estos artículos se pueden encontrar en la Tabla de materiales.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (UAB). 1. Configuración del equipo de conducción de ultrasonido enfocado Utilice cables BNC coaxiales de 50 Ohmios para conectar (1) la entrada del transductor de ultrasonido a la salida del amplificador rf y (2) la entrada del amplificador rf a la salida del generador de funciones. Ajuste el modo generador de funciones a una ráfaga …

Representative Results

Aquí, demostramos que el ultrasonido enfocado con microburbujas puede inducir la apertura BBB localizada utilizando los parámetros especificados anteriormente con el transductor de inmersión de baja potencia (Figura 3) y el transductor FUS (Figura 4). En primer lugar, en los primeros experimentos, el transductor de inmersión de baja potencia estaba dirigido a un hemisferio cerebral ya sea anterior(Figura 3b)o medial (<strong cla…

Discussion

Aquí describimos un enfoque de sobremesa para la apertura fus BBB asistida por microburbuja con enfoques alternativos, incluyendo, dos transductores diferentes y métodos para la segmentación intracraneal con y sin orientación de RMN. Actualmente, con el fin de establecer la apertura FUS BBB guiada por RMN en el laboratorio, existe la opción de comprar excelentes dispositivos listos para usar que proporcionan resultados altamente estandarizados y reproducibles con interfaces fáciles de usar. Sin embargo, muchos labo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada en parte por una subvención de infraestructura de investigación EPSCoR del NSF a la Universidad de Clemson (1632881). Además, esta investigación fue apoyada en parte por el Civitan International Research Center, Birmingham, AL. Los autores reconocen con gratitud el uso de los servicios e instalaciones de la Universidad de Alabama en Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Los autores reconocen a Rajiv Chopra por su apoyo y orientación.

Materials

Bubble shaker Lantheus Medical Imaging VMIX VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles
Catheter plug/ Injection cap SAI infusion technologies Part Number: IC Catheter plug/ Injection cap
Evans blue dye Sigma E2129-10G Evans blue dye
Function generator Tektronix AFG3022B Dual channel, 250MS/s, 25MHz
FUS transducer, 1.1MHz FUS Instruments TX-110 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone
Heating pad for Mice and Rats Kent Scientific PS-03 Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats
Infusion pump KD Scientific 780100 KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump
Kapton tape Gizmo Dorks https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91		 Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack
Low power immersion transducer, 1MHz Olympus V303-SU Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF
Magnet sets WINOMO https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		 WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets
RF amplifier E&I A075 75W
Tail vein catheter BD 382512/ Fisher Item: NC1228513 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged)
Ultrasound contrast microbubbles Lantheus Medical Imaging DE4, DE16 DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere)
Ultrasound gel Aquasonic https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		 Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle
Winged infusion sets, 22ga. Fisher Healthcare 22-258087 Terumo Surflo Winged Infusion Sets
motor controller software N/A N/A custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller
runtime environment for the motor controller software National Instruments LabView runtime engine version 2017 or better https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) Velmex
bolts Velmex MB-1 BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3
motor controller Velmex VXM-3 Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6
mounting cleats Velmex MC-2 Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2
usb to serial converter Velmex VXM-USB-RS232 USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1
x-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
x-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
y-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
y-axis stepper motor Velmex PK266-03A-P1 Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis damper Velmex D6CL-6.3F D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
z-axis linear stage Velmex MN10-0100-M02-21 BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1
z-axis stepper motor Velmex PK266-03B-P2 Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1
3D printable files
Immersion transducer mount and pointer https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaxic frame https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaxic frame holder https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9.4T small bore animal MRI Bruker Bruker BioSpec 94/20 ParaVision version 5.1
AAV9-hsyn-GFP Addgene
Cream hair remover Church & Dwight Nair cream
gadobutrol MRI contrast agent Bayer Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotactic frame Stoelting #51500 not MRI compatible
turnkey FUS delivery device FUS Instruments RK-300 ready to use MRI compatible FUS for rodents
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Referências

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Keywords: Focused UltrasoundBlood-brain BarrierRat ModelMicro-bubblesMRIStereotaxic FrameBrain RegionAnesthesiaCatheterTail Vein
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Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).
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