쥐 모델에서 집중 초음파를 사용하여 위치 특정 혈액 뇌 장벽 개방에 대한 벤치 탑 접근
Summary
마이크로 버블 에이전트를 가진 집중한 초음파는 혈액 두뇌 장벽을 초점하고 일시적으로 열 수 있습니다. 이 기술은 혈액 뇌 장벽을 통해 에이전트의 넓은 범위를 제공하기 위해 사용되었습니다. 이 문서에서는 MRI 지침유무이드 없이 설치류 뇌에 국소화된 전달을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
스테레오탁스 수술은 설치류 뇌에 국소화된 약물 및 유전자 전달을 위한 금본위제입니다. 이 기술은 대상 뇌 영역에 정확한 국소화및 대상 부작용의 감소를 포함하여 전신 전달에 비해 많은 장점이 있습니다. 그러나, 스테레오 탁스 수술은 그것의 번역 효능을 제한 하는 매우 침략, 긴 복구 시간을 필요, 여러 뇌 영역을 대상으로 할 때 도전을 제공. 집중 초음파(FUS)는 순환 마이크로버블과 함께 밀리미터 크기의 영역에서 혈액 뇌 장벽(BBB)을 일시적으로 개방하는 데 사용될 수 있다. 이를 통해 일반적으로 BBB를 교차할 수 없는 체계적으로 전달된 에이전트의 원두개 내 지역화를 가능하게 합니다. 이 기술은 스테레오 탁스 수술에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 그러나 현재까지이 기술은 장비 및 표준화 된 방법에 대한 제한된 접근으로 인해 신경 과학 실험실에서 널리 채택되지 않았습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 저렴하고 재현 가능하므로 모든 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 FUS BBB 개방 (BBBO)에 벤치 탑 접근 방식을 제공하는 것입니다.
Introduction
기본적인 신경과학에서 많은 발견에도 불구하고, 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 대한 새로운 치료의 수는 상대적으로 제한된남아1,2. 신경 장애에 관여하는 유전자, 분자 및 세포 회로에 대한 깊은 이해는 현재 기술3을가진 인간에서 실현 할 수없는 유망한 치료법을 제안했습니다. 효과적인 치료는 종종 뇌 침투 및 사이트 별4,5,6,7,8의필요성에 의해 제한됩니다. 그러나, 특정 뇌 부위에 국소화된 약물 전달의 기존 방법(예를 들어, 주사 또는 캐뉼라를 통한 전달)은 침습적이며 두개골9에서개구부를 필요로 한다. 이 수술의 침습성은 인간의 뇌에 국소 전달의 일상적인 사용을 방지. 또한, 조직 손상 및 그 결과 염증 반응은 유비쿼터스 상반신 주사에 의존하는 기본 및 전임상 연구를 위해 혼동된다10. 비침습적으로 혈액 뇌 장벽에 걸쳐 에이전트를 제공 하는 기능 (BBB) 특정 뇌 영역에 그들을 대상으로 신경 장애에 대 한 치료에 엄청난 영향을 미칠 수 있습니다., 동시에 전임상 연구에 대 한 강력한 조사 도구를 제공 하는 동안.
최소한의 조직 손상을 가진 BBB를 가로지르는 표적 수송의 한 가지 방법은 마이크로버블과 함께 경두개 중형 초음파(FUS)로BBB11,12,13,14,15,16을집중적으로 열고 일시적으로 개방한다. FUS BBB 개구부는 신경영양인자17,18,19,유전자 치료20,21,22,항체23,신경전달물질24,나노입자25,26,27, 28,28, 29등뇌 영역을 대상으로 치료제를 국소화하여 신경퇴행성 질환, 뇌졸중 및 신경교종의 치료에 대한 최근 주목받고 있다. 광범위한 응용 분야와 비침습적 특성30,31을통해 FUS BBB 개방은 일상적인 입체 적 내 주사에 이상적인 대안입니다. 더욱이,인간30,32에서의현재 사용으로 인해, 이 기술을 이용한 전임상 조사는 매우 번역적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, FUS BBB 개방은 접근성의 부족으로 인해 기초 과학 및 전임상 연구에서 널리 확립 된 기술이 될 아직. 따라서 FUS BBB 개구부에 대한 벤치탑 접근 방식에 대한 자세한 프로토콜을 이 기술을 수립하는 데 관심이 있는 실험실의 출발점으로 제공합니다.
이러한 연구는 FUS 특이적 초음파 트랜스듀서 또는 저전력 댐프 형 초음파 침지 변환기중 고출력 공기로 수행되었다. 트랜스듀서는 반응형 부하및 표준 벤치탑 기능 발생기를 위해 설계된 RF 전원 증폭기로 구동되었습니다. 이러한 항목에 대한 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.
Protocol
모든 실험 절차는 UAB 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 중점 초음파 운전 장비 설정 50개의 Ohm 동축 BNC 케이블을 사용하여 RF 증폭기의 출력에 초음파 트랜스듀서의 입력(1)을 연결하고 (2) RF 증폭기의 입력을 기능 발생기의 출력에 연결한다. 기능 발생기 모드를 1% 듀티 사이클로 초당 한 번 부비동성 버스트로 설정합니다. <l…
Representative Results
여기서, 우리는 마이크로버블을 이용한 집중초음파가 저전력 침수 트랜스듀서(도3)와FUS 트랜스듀서(도4)를모두 사용하여 위에 지정된 파라미터를 사용하여 국소화된 BBB 개방을 유도할 수 있음을 입증한다. 첫째, 초기 실험에서 저전력 침수 트랜스듀서는전방(도 3b)또는 내측(도3a)의뇌 반구 를 표적으로 삼았…
Discussion
여기에서 우리는 마이크로 버블에 대한 벤치탑 접근 방식이 MRI 지침의 유무에 관계없이 두개 내 표적화에 대한 두개 내 표적화 방법, 두개 내 표적을 위한 두가지 변형 및 방법을 포함하여 대체 접근 방식으로 FUS BBB 개방을 지원했습니다. 현재 랩에 MRI 유도 FUS BBB 개구부를 설치하기 위해 사용자 친화적인 인터페이스를 통해 매우 표준화되고 재현 가능한 결과를 제공하는 우수한 즉시 사용할 수 있…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 클렘슨 대학에 NSF EPSCoR 연구 인프라 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (1632881). 또한, 이 연구는 시비탄 국제 연구 센터, 버밍엄, AL에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 감사 버밍엄 작은 동물 이미징 공유 시설 보조금 [NIH P30 CA013148]에서 앨라배마 대학의 서비스와 시설의 사용을 인정합니다. 저자들은 라지브 초프라의 지지와 지도에 대해 인정한다.
Materials
| Bubble shaker | Lantheus Medical Imaging | VMIX | VIALMIX, actiation device used to activate Definity microbubbles |
| Catheter plug/ Injection cap | SAI infusion technologies | Part Number: IC | Catheter plug/ Injection cap |
| Evans blue dye | Sigma | E2129-10G | Evans blue dye |
| Function generator | Tektronix | AFG3022B | Dual channel, 250MS/s, 25MHz |
| FUS transducer, 1.1MHz | FUS Instruments | TX-110 | 1 MHz MRI-compatible spherically focused ultrasound transducer with a hydrophone |
| Heating pad for Mice and Rats | Kent Scientific | PS-03 | Heating pad- PhysioSuite for Mice and Rats |
| Infusion pump | KD Scientific | 780100 | KDS 100 Legacy Single Syringe Infusion Pump |
| Kapton tape | Gizmo Dorks | https://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_GbR7Db56HKD91 |
Gizmo Dorks Kapton Tape (Polyimide) for 3D Printers and Printing, 8 x 8 inches, 10 Sheets per Pack |
| Low power immersion transducer, 1MHz | Olympus | V303-SU | Immersion Transducer, 1 MHz, 0.50 in. Element Diameter, Standard Case Style, Straight UHF Connector, F=0.80IN PTF |
| Magnet sets | WINOMO | https://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC |
WINOMO 15mm Sew In Magnetic Bag Clasps for Sewing Scrapbooking – 10 Sets |
| RF amplifier | E&I | A075 | 75W |
| Tail vein catheter | BD | 382512/ Fisher Item: NC1228513 | 24g BD Insyte Autoguard shielded IV catheters (non-winged) |
| Ultrasound contrast microbubbles | Lantheus Medical Imaging | DE4, DE16 | DEFINITY (Perflutren Lipid Microsphere) |
| Ultrasound gel | Aquasonic | https://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/ ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P |
Ultrasound Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Squeeze Bottle |
| Winged infusion sets, 22ga. | Fisher Healthcare | 22-258087 | Terumo Surflo Winged Infusion Sets |
| motor controller software | N/A | N/A | custom software written in LabView for controlling the Velmex motor controller |
| runtime environment for the motor controller software | National Instruments | LabView runtime engine version 2017 or better | https://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html |
| 3 axis Linear stage actuator (XYZ positioner) | Velmex | ||
| bolts | Velmex | MB-1 | BiSlide Bolt 1/4-20×3/4" Socket cap screw (10 pack), Qty:3 |
| motor controller | Velmex | VXM-3 | Control,3 axis programmable stepping motor control, Qty:1 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:6 |
| mounting cleats | Velmex | MC-2 | Cleat, 2 hole BiSlide, Qty:2 |
| usb to serial converter | Velmex | VXM-USB-RS232 | USB to RS232 Serial Communication Cable 10ft, Qty:1 |
| x-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| x-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| y-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| y-axis stepper motor | Velmex | PK266-03A-P1 | Vexta Type 23T2, Single Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis damper | Velmex | D6CL-6.3F | D6CL Damper for Type 23 Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| z-axis linear stage | Velmex | MN10-0100-M02-21 | BiSlide, travel=10 inch, 2 mm/rev, limits, NEMA 23, Qty:1 |
| z-axis stepper motor | Velmex | PK266-03B-P2 | Vexta Type 23T2, Double Shaft Stepper Motor, Qty:1 |
| 3D printable files | |||
| Immersion transducer mount and pointer | https://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq | ||
| Stereotaxic frame | https://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH | ||
| Stereotaxic frame holder | https://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX | ||
| 9.4T small bore animal MRI | Bruker | Bruker BioSpec 94/20 | ParaVision version 5.1 |
| AAV9-hsyn-GFP | Addgene | ||
| Cream hair remover | Church & Dwight | Nair cream | |
| gadobutrol MRI contrast agent | Bayer | Gadavist (Gadobutrol, 1mM/mL) | |
| Stereotactic frame | Stoelting | #51500 | not MRI compatible |
| turnkey FUS delivery device | FUS Instruments | RK-300 | ready to use MRI compatible FUS for rodents |
Referências
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Citar este artigo
Rich, M., Whitsitt, Q., Lubin, F., Bolding, M. A Benchtop Approach to the Location Specific Blood Brain Barrier Opening using Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (160), e61113, doi:10.3791/61113 (2020).