Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

De nauwe regulering van de eiwitfunctie en -stabiliteit is van het grootste belang, omdat ze belangrijke aanjagers zijn van fenotypische controle van de biologie. De functie van een eiwit is opgebouwd uit twee componenten: de intrinsieke polypeptidesequentie en eventuele posttranslationele modificaties (PTM’s). Er zijn verschillende chemische PTM’s geïdentificeerd, waaronder glycosylatie, fosforylering, acetylatie en methylatie¹. In 1975 identificeerden Goldstein et al.² een klein eiwit en noemden het alomtegenwoordig vanwege zijn alomtegenwoordige aard. Ubiquitin bleek belangrijk te zijn bij eiwitafbraak³. Sindsdien is echter vastgesteld dat de functie van alomtegenwoordigheid als signaalmolecuul veel verder reikt dan de regulering van eiwitstabiliteit. Ubiquitin-signalering is betrokken bij een breed scala aan andere biologische functies, zoals eiwitstabilisatie, autofagie, celcycluscontrole en eiwithandel⁴.

Terwijl andere PTM’s over het algemeen binair zijn (d.w.z. het eiwit wordt gewijzigd of ongewijzigd gelaten) voor een bepaalde site, kan ubiquitin een eiwit zowel als monomeer als als polymere keten wijzigen, waarbij de bijgevoegde ubiquitin zelf wordt alomtegenwoordig. Verder kan deze polyubiquitinatieketen zich in verschillende topologieën ontwikkelen met de alomtegenwoordigheid van de vorige ubiquitin die zich hecht aan een van de acht koppelingsplaatsen^5,6. Ubiquitin wordt overgedragen door een multistep enzymatisch proces (Figuur 1) waarbij het C-eindpunt van ubiquitin is gekoppeld aan een van de zeven lysineresiduen (K06, K11, K27, K29, K33, K48 of K63) of de N-terminal van de vorige ubiquitin (aangeduid als de M1 of lineaire ubiquitinatie)^5,6. Deze ketentopologie is de sleutel tot het lot van het eiwit onder modificatie. De modificatie met een K48- of K11-gekoppelde keten leidt bijvoorbeeld tot de afbraak van het gemodificeerde eiwit bij het proteasoom, terwijl een lineaire keten nodig is voor de activering van NF-kB-signalering. De relatieve verdeling van deze ketentopologieën is dus relevant voor een breed scala aan biologische vragen.

Het gebruik van massaspectrometrie (MS) is van bijzonder belang voor de analyse van de ubiquitinketentopologie, omdat het niet afhankelijk is van op antilichamen gebaseerde of op affiniteit gebaseerde interacties^7,8, waarvan er vele een beperkte specificiteit hebben en geen onderscheid maken tussen de verschillende ketentypen. Een andere detectiemogelijkheid is het gebruik van genetisch gemodificeerde ubiquitin mutanten. Hier wordt een specifieke lysine ingeruild voor arginine, die de modificatie door ubiquitin niet kan ondersteunen. Het gebrek aan ubiquitin ketenvorming op het substraateiwit wordt vervolgens geïnterpreteerd als bewijs voor een specifieke topologie⁹.

Ms-gebaseerde identificatie van alomtegenwoordige eiwitten is gebaseerd op het feit dat het C-eindpunt van ubiquitin een arginineresidu in positie 74 bevat dat door trypsine wordt herkend tijdens de proteolytische bereiding van de monsters voor MS-analyse, waarbij de C-terminale dubbele glycine wordt gescheiden. Deze GlyGly (-GG) blijft verbonden met de ε-aminogroep van het lysineresidu van het substraateiwit. Voor ubiquitin topologie analyse, de wijziging vindt plaats op een van de zeven lysine residuen van ubiquitin. Hierdoor ontstaat een set van zeven belangrijke peptiden die een lysineresidu bevatten dat wordt gewijzigd door GG, specifiek voor elk van de topologieën (Figuur 2). Bijvoorbeeld, met K06 topologie, de lysine op positie 6 op de aminozuur volgorde zal worden beschermd tegen tryptische spijsvertering met een -GG modificatie van 114 Da toegevoegd aan deze lysine.

Identificatie van specifieke vooraf bepaalde peptiden door MS wordt aangeduid als gerichte proteomics, of meer specifiek, gerichte peptide acquisitie¹⁰. Afhankelijk van de prestaties van de gebruikte massaspectrometer zijn twee methoden ontwikkeld. Dit zijn selected reaction monitoring (SRM), ook wel multiple reaction monitoring (MRM) en parallel reaction monitoring (PRM) genoemd. SRM omvat de selectie van overgangen bestaande uit de precursor m/z en het product ion m/z. Omgekeerd vereist PRM alleen de voorloper m/z. Na de selectie wordt een volledige enquêtescan van de productionen uitgevoerd. Dit heeft als voordeel dat vóór de meting geen geschikte productionen voor kwantificering op de specifieke massaspectrometer nodig zijn^. Zowel SRM als PRM kunnen, afhankelijk van het instrument, worden ingepland. Planning is de praktijk van het toewijzen van een tijdvenster waarin een bepaald ion zal worden opgenomen voor analyse, omdat peptiden eluting op gedefinieerde retentietijden van het chromatografische systeem. Het verminderen van het aantal ionen dat op een bepaald moment wordt ondervraagd, verhoogt de frequentie van ondervraging van die ionen die op dat moment zijn gepland, waardoor de nauwkeurigheid van de gegevens wordt verbeterd.

Over het algemeen is de toepassing van gerichte proteomica voor alomtegenwoordige topologie hetzelfde als elk ander gericht proteomics-experiment. Twee belangrijke verschillen zijn echter belangrijk: ten eerste moet rekening worden gehouden met de stabiliteit van alomtegenwoordige ketens. Er zijn meerdere krachtige deubiquitinerende enzymen (DUBs) die snel ketens afbreken bij cellysis. De alomtegenwoordige proteasen vallen in twee categorieën, de thioesterases en metalloproteases. De meeste ubiquitin-hydrolasen zijn thioesterases en dragen een cysteïneresidu in hun actieve centrum. Door dit cysteïneresidu te alkyleren, kunnen ze worden geactiveerd. Als zodanig is het gebruik van ubiquitin stabilisatiebuffers die alkylerende middelen bevatten, zoals N-ethylmaleimide (NEM), en sterk denaturerende chemicaliën, en het gekoeld houden van monsters van vitaal belang voor een succesvolle analyse. Ten tweede, in tegenstelling tot andere gerichte experimenten, is de peptidekeuze vast. In een typisch gericht experiment kan een proteotypisch peptide worden geselecteerd voor goede chromatografische en ionisatieprestaties. Voor sommige topologie-karakteristieke peptiden zoals K48 zijn deze eigenschappen goed, terwijl ze voor anderen minder wenselijk zijn. K33-chromatografie in een typische omgekeerde fase-instelling is bijvoorbeeld slecht vanwege de vorming van een uitgerekt elutieprofiel en de slechte ionisatie-eigenschappen van het K27-peptide verminderen de zichtbaarheid met MS¹².

In dit protocol beschrijven we hoe we een alomtegenwoordige topologiebeoordeling van een biologisch monster door PRM kunnen uitvoeren. Voorbeeldgegevens voor de procedure worden gepresenteerd met behulp van een verstoring van het proteasoom met behulp van MG-132-remmerbehandeling in verschillende celtypen.