通过并行反应监测进行无处不在的链分析

密切调节蛋白质的功能和稳定性至关重要，因为它们是生物学表型控制的主要驱动因素。蛋白质的功能由两个组成部分构成：其内在多肽序列和任何后翻译修饰（PTM）。已发现各种化学PTM，包括糖化、磷化、乙酰化和甲基化^1。1975年，Goldstein等人^发现了一种小蛋白质，并将其命名为无处不在的蛋白质。发现无处不在素在蛋白质降解³中很重要。然而，自那时以来，人们已经确定，无处不在的素作为一种信号分子的功能远远超出了蛋白质稳定性的规定。无处不在的信号涉及广泛的其他生物功能，如蛋白质稳定，自噬，细胞循环控制，和蛋白质贩运^4。

虽然其他PTM通常是二元的（即，蛋白质被修改或未修改）为给定部位，无处不在的素可以修改蛋白质作为单体或聚合物链，与附加的无处不在本身无处不在。此外，这个多基化链可以在几个道歉中发展，与以前无处不在的无处不在连接到八个链接站点之一^5，6。无处不在素通过多步酶过程（图1）转移，其中无处不在素的C-终点站与其七个赖氨酸残留物之一（K06， K11、K27、K29、K33、K48或K63）或N端的先前无处不在（称为M1或线性无处不在^）5、6。这种链条拓扑是被修改蛋白质命运的关键。例如，使用 K48 或 K11 链进行修饰会导致蛋白酶体中修改后的蛋白质降解，而线性链对于 NF-kB 信号的激活是必要的。因此，这些链条的相对分布与各种各样的生物学问题有关。

质谱仪 （MS） 的使用对无处不在的链式拓扑分析特别有益，因为它不依赖于基于抗体或亲和力的相互作用^7，8， 其中许多具有有限的特异性，不区分不同的链类型。另一种检测可能性是使用转基因无处不在的突变体。在这里，一个特定的莱辛被交换为精氨酸，这不能支持通过无处不在的修改。基板蛋白缺乏无处不在的链形成，然后被解释为特定拓扑⁹的证据。

基于MS的无所不在蛋白质的鉴定基于这样一个事实，即无处不在的素的C-终点站含有74位的精氨酸残留物，在进行MS分析的样品的蛋白质分析准备过程中，由肌氨酸识别，分离C端双糖氨酸。这种甘油（-GG）仍然附着在基板蛋白赖氨酸残留物的ε-氨基蛋白组。对于无处不在的拓扑分析，该修饰发生在无处不在的七个赖氨酸残留物之一。这创建了一组七个关键肽，携带由 GG 修改的赖氨酸残留物，具体用于每个道歉 （图 2）。例如，使用 K06 拓扑，氨基酸序列中位置 6 的 lysine 将通过 -GG 修改 114 Da 添加到此 lysine 中来防止尝试消化。

MS 对特定预定肽的识别称为靶向蛋白质组学，或更具体地说，定向肽获取¹⁰。根据所使用的质谱仪的性能，已经开发出两种方法。这些是选定的反应监测 （SRM），也称为多反应监测 （MRM） 和并行反应监测 （PRM）。SRM 涉及由前体 m/z 和产品离子 m/z 组成的过渡选择。相反，PRM 只需要前体 m/z。选后，对产品离子进行全面的调查扫描。这样做的好处是，在测量¹¹之前，不需要选择合适的产品离子来量化特定的质谱仪。SRM 和 PRM 都可以根据仪器进行安排。调度是分配一个时间窗口的实践，在此期间将包括一个特定的离子进行分析，因为肽在色谱系统的定义保留时间排出。减少在任何给定时间接受审讯的离子数量，增加当时预定的离子的审讯频率，从而提高数据准确性。

一般来说，靶向蛋白质组学在泛素拓扑学中的应用与任何其他靶向蛋白质组学实验相同。然而，两个关键区别是重要的：第一，必须考虑无处不在的链条的稳定性。有许多有效的脱脂酶（DUB），在细胞裂解后迅速降解链条。无处不在的特异性蛋白酶分为两类，硫化物和金属蛋白酶。大多数无处不在的水激光是硫酯酶，并在其活动中心携带一个半胱氨酸残留物。通过碱化这种半胱氨酸残留物，它们可以灭活。因此，使用含有烷基化剂（如 N-乙酰卤化物 （NEM） 和高度变性化学品）的无处不在的稳定缓冲器，并保持样品冷却，对于成功的分析至关重要。其次，与其他有针对性的实验不同，肽的选择是固定的。在典型的靶向实验中，可以选择一种蛋白肽，以获得良好的色谱和电离性能。对于一些拓扑特性的肽，如K48，这些属性是好的，而对于其他人，他们是不太可取的。例如，由于形成拉伸的弹性轮廓，典型逆相设置中的 K33 色谱不佳，K27 肽的电传性能差，其可见性降低了 MS^12。

在此协议中，我们描述了如何通过 PRM 对生物样本进行无处不在的拓扑学评估。该过程的示例数据使用MG-132抑制剂治疗在几种不同细胞类型的蛋白酶体的扰动显示。